基于pcr原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链dna在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在taq dna聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度taq dna酶仍有较高的催化活性）。
1、变性温度与时间：
变性温度低，解链不*是导致pcr失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板dna变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或pcr产物*变性，就会导致pcr失败。
2、退火（复性）温度与时间：
退火温度是影响pcr特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板dna比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，g+c含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
tm值（解链温度）=4(g+c)+2(a+t)
复性温度=tm值-(5～10℃）
在tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高pcr反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间*结合。
3、延伸温度与时间：taq dna聚合酶的生物学活性：
70～80℃150核苷酸/s/酶分子
70℃60核苷酸/s/酶分子
55℃24核苷酸/s/酶分子
高于90℃时，dna合成几乎不能进行。
pcr反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。pcr延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的dna片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。