一.环氧树脂(epoxy resin)
1.环氧树脂简介
环氧树脂是一类具有末端环氧基的甘油多聚酯。它的分子中有两种反应基团,即环氧基团(epoxide group)和氢氧基团(hydroxyl group)。其末端基团易与含有活性氢原子的化合物如胺类(如dmp-30,dmae,乙二胺等,又称催化剂或加速剂)反应,使单体首尾相连接形成长链聚合物。此外,在单体中的氢氧基团能与有机酸酐(如mna,ddsa,九烷基琥珀酸酐,nsa等,又称硬化剂或固化剂)结合,使单体分子形成横桥。所以,环氧树脂以单体渗入细胞组织,而这种单体在一定的温度条件下,在硬化剂和加速剂作用下,就形成一个非常耐溶剂和耐化学腐蚀的交链稳定的三维空间聚合体。为了改善聚合体(包埋块)的切割性能,还会在环氧树脂包埋配方中加入增塑剂,以调节包埋块的韧性。
环氧树脂包埋剂对细胞微细结构有较好的保存性能,聚合后体积缩小较少,而且在真空中能经受较长时间的轰击。但它的操作不太方便,反差较弱。
环氧树脂的型号较多,常用epon812,spurr树脂(erl-4206)等。
2.2.1 epon812包埋剂
epon812是一种进口树脂,它是一种长链的脂肪族环氧化合物,是目前上普遍采用的一种优良包埋剂,粘度为150-210cp(在25℃条件下)。该包埋剂的配制方法甚多,但一般都按1961年luft提出的配方进行。
其配方如下:
a液:epon812 62ml ddsa 100ml
b液:epon812 100ml mna 89ml
上述配方若改变a液和b液的比例则可调节聚合块硬度,a液多则软,b液多则硬。通常冬天使用a:b=2:8(v/v);夏天使用a:b=1:9(v/v),可视组织的硬度和气候不同选择其比例。配制时可先分别配制a液和b液,然后将a液和b液按一定比例混合后,再加入1%-2%的加速剂,边加边搅拌,使其充分混合。为了方便操作,也有人将epon812,ddsa,mna三种成分按一定比例直接混合使用。epon812的聚合温度为:37℃过夜,60℃ ,24-36h。 根据南方地区的气候条件,可用下列配方:
epon812 51ml ddsa 12ml mna 37ml dmp-30 1.8-2ml
聚合条件:室温过夜,60℃, 8-12h。
ddsa是十二烷基琥珀酸酐(dodecenylsuccinic anhydride)的简称。它是一种可得到软性包埋块的长链脂肪族分子。
mna是甲基内次甲基二甲酸酐(methyl nadic anhydride)的简称,又称六甲酸酐,它有两个链环,能获得较硬的包埋块。
dmp-30是2,4,6-三(二甲基氨基甲基)*(2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol)的简称。它能加速固化过程。
2.2 spurr树脂(erl-4206包埋剂)
这是1969年由spurr推荐使用的包埋剂,所以也称spurr树脂。它含有两个环氧基,是一种低粘度(25℃时,7-10cp)的环氧树脂。由于具有粘度低的特点,所以近年来一些实验室已开始使用它。其配方可按下表中各种成分的比例,即可获得不同性能的包埋块。其配方如下:
vcd是二氧化乙烯环己烯(vinylcyclohexene dioxide)的简称。它的分子小,粘度低,聚合块硬度大。
der-736是diglycidyl ether of a polypropylene glycol的简称。它属于脂肪族,分子小,有低粘度性质,可调节包埋块的硬度。 nsa是nonenylsuccinic anhydride的简称。它是一种特殊的硬化剂,应避免暴露在潮湿的大气中,以防环氧或酐链的水解作用。
dmae是dimethylaminoethanol的简称。它是催化剂,增加催化剂的比例,可以缩短聚合的时间。 spurr树脂终硬度可用der-736的量来调节。配制时,先把前三种成分混合后,后才加入dmae,但从开始到混合完成,达到淡黄色状态需3-7天。此包埋剂在70℃,一般8小时即可*聚合,用陈旧的包埋剂时,则聚合时间会减少。因spurr树脂嗜氧,聚合时不要加盖。包埋剂是用新鲜配制,但为了方便,可预先配制好保存在低温和防潮的环境中。spurr树脂与epon812树脂相比粘度低,操作方便,但毒性比epon812树脂大,所以操作时要更加小心,此外,spurr树脂各成分间的分子量大小差异较大,在组织中的渗透速度不一,容易个别成分造成渗透不均,而导致局部聚合不*,染色效果不佳。
二.丙烯酸树脂(acrylic resin)
1. 丙烯酸树脂简介
丙烯酸树脂无色透明的,由丙烯酸衍生物聚合而成。丙烯酸单体粘度低,可以在低温下渗透及聚合,因而能满足免疫和细胞化学技术低温操作的要求。其聚合方式有两种,热聚合和紫外线照射聚合。但它对脂类等成分的抽提比环氧树脂严重,为此它也需要在较低的温度下使用才可能减少抽提作用。此外,聚合前后丙烯酸树脂的体积变化较环氧树脂大(体积大约收缩10%-20%),并且它在电子束的照射下稳定性比环氧树脂低,放热的聚合过程可引起组织细胞结构的损伤,致敏性也比环氧树脂强,使用时要小心防护。一般来说,除了免疫和细胞化学技术外,超微结构的研究并不推荐使用它。
在电镜中使用较多的丙烯酸树脂有伦敦白胶(lr white)和lowicryl系列的树脂。
2.2.1 伦敦白胶(lr white)
伦敦白胶含有7种不同的丙烯酸单体和2种增塑剂,引发剂是bpo(dibenzoyl peroxide),加速剂为n,n-dimethyl paratoluidine,但具体的配方和成分没有报道。它的粘度低,渗透能力强,可用于较大的组织块或致密的组织,由于它有一定的亲水性,方便水性染料进入,染色效果佳,使用非常方便,通常买回来的是已经混合好的试剂,但由于bpo已经加入,必须一直保存在4℃中,以防其自发聚合,即便这样,它的有效期仅为12个月。伦敦白胶可以微溶于水,因而可以采用部分脱水方案,但不能使用丙酮作为脱水剂。氧气会抑制聚合反应的进行,因而聚合时要在模块中注满包埋剂并盖紧盖子。
此外,伦敦白胶不能在-15℃以下的温度使用。为了方便运输和储存,也有未加bpo的伦敦白胶(uncatalysed lr white)出售,这种试剂需要加入催化剂(9.9g催化剂/500glr white)充分搅拌并室温放置24小时以上才能使用。充分混合的包埋剂同样保存在4℃中,一旦加入催化剂后,它的有效期便为12个月。
2.2 lowicryl系列包埋剂
lowicryl系列包埋剂是专为低温(-20℃以下)包埋设计的包埋剂。它有两种类型:一种是极性树脂,k4m(低渗透温度为-30℃,低聚合温度为-50℃)和k11m(低渗透温度为-60℃,低聚合温度为-60℃);另一种是非极性树脂,hm20(低渗透温度为-50℃,低聚合温度为-50℃)和hm23(低渗透温度为-80℃,低聚合温度为-80℃)。
极性树脂亲水,使样品保存在一个水性的环境中从而较少蛋白质变性,且染色的效果较好。而非极性树脂的切割性能比较好。两种树脂通常都在隔绝氧气的情况下低温紫外线照射聚合。