rt-pcr试剂盒合适的温度通常在45-68℃之间(预备实验可2℃间隔进行)。另外，由于在60-68℃间，也有很高的活性，因此可在此温度范围内设定温度，进行2 step pcr。rt-pcr试剂盒是为两步法rt-pcr一步实验配制的，具有高灵敏度的rt-pcr反应系统，可以从极低量的总rna或poly(a)+rna合成一链cdna。与pcr反应相结合，可用于检测稀有基因的表达、从极少量细胞中定量检测特定mrna的表达水平、克隆特定基因的cdna片段等。合理配备与cdna一链合成反应相关的各种组分，该试剂盒有高效的逆转录酶活性，对后续的pcr或定量pcr实验兼容性好，适合于各种pcr耐热聚合酶。
rt-pcr试剂盒试验时进行的pcr反应：
1.吸取10%的一链反应液（2μl）进行pcr反应；即使加入更多量的一链反应液也不能增加其扩增的产物量，反而可能会抑制正常的pcr反应；
2.94℃加热变性2min；
3.设置15-40个pcr循环。退火与延伸条件依引物和模板而定。
相关注意事项：
1.用于cdna合成反应的溶液试剂尽量可能用depc进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。
2.rna样品要避免基因组dna污染。
3.避免多次反复冻融rna，使rna保持在冰浴中处融化状态。
4.试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。
5.cdna产物应置于-20℃保存。