一、个人总结的成败因素:
1. 有效裂解细胞。
2. 恰当选择处理样本的方式:超声或酶处理。
3. 选用适当适量抗体。
4. 恰当设置对照。
5. 不要过分交联dna-蛋白质。
6. 交联所用的甲醛终浓度约为1%,交联时问需要预实验来确定。
7 . 注意pcr策略具体来说:恰当设置chip实验对照,设置适当的阳性和阴性对照是进行chip结果分析的重要步骤和trouble shooting的依据,因为非特异性的免疫沉淀难以避免。
一般的设置方法
1 未经免疫沉淀的超声处理后样本( input)。
2 加特异抗体来源动物的正常血清或无关抗体(mock)。
3 阳性对照引物的应用。
4 选择不与目的蛋白质结合的基因组区域作对照。
如 阳性对照抗体 (anti-acetyl-histone h3)
* 阴性对照抗体 (normal rabbit igg)
* pcr引物 (control primer specific for human gapdh)
二 、抗体选择,尽可能选择试剂公司验证过的chip级抗体,如upstate公司。
与目的蛋白比,抗体应过量,预实验确定抗体用量,选用高质量高滴度抗体。
抗体识别位点不是dna-pro结合的位点。
三、chip耗时长,什么时候能够停止并且冷冻样本?
i. 甲醛固定和冲洗以后离心下形成的细胞球状聚合体。
ii. 细胞溶液(lysate)。
iii. 声波裂解染色质后。
iv. 在逆转交联后。
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