1.细胞系培养初期:保证培养基与微球体处于稳定的ph与温度水平,接种细胞(对数生长期,而非稳定期)至终体积1/3的培养液中,以增加细胞与微载体接触的机会。不同的微载体所用浓度及接种细胞密度是不同的。常使用2-3g/l的微载体含量,更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。
2.贴壁阶段(3-8d)后,缓慢加入培养液至工作体积,并且增加搅拌速度保证*均质混合。
3.培养维持期:进行细胞计数(胞核计数)、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随意细胞系增殖,微球变得越来越重,需增加搅拌速率。经过3d左右,培养液开始呈酸性,需换液:停止搅拌,让微珠沉淀5min,弃掉适宜体积的培养液,缓慢加入新鲜培养液(37℃),重新开始搅拌。
4.收获细胞:首先排干培养液,至少用缓冲液漂洗1遍,然后加入相应的酶,快速搅拌(75-125r/min)20-30min。然后解离收集细胞及其产品。
5.微载体培养的放大:可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞系培养疫苗、干扰素,已被放大至4000l以上。