1、模板原因
① 模板中含有杂蛋白质。
② 模板中含有taq酶抑制剂。
③ 模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白。
④ 在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤ 模板核酸变性不*。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
2、酶失活
① 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。
② 忘加taq酶或溴乙锭。
3、引物
① 引物质量。
② 引物的浓度。
③ 两条引物的浓度是否对称。
解决对策：
① 选定一个好的引物合成单位。
② 引物的浓度不仅要看od值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做pcr有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③ 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④ 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
4、mg2+浓度
① 浓度过高降低pcr扩增的特异性。
② 浓度过低影响pcr扩增产量甚至使pcr扩增失败而不出扩增条带。
5、反应体积的改变
① 通常进行pcr扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，应用多大体积进行pcr扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定;
② 在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
6、物理原因
① 变性对pcr扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性。
② 退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低pcr扩增效率。
③ 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度有问题。
7、靶序列变异
① 靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合。
② 靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列。