细胞cdk1/cyclin b激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
细胞cdk1/cyclin b激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物，受到cdk1/cyclin b磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生adp过程中，伴随的还原型腺嘌呤二核苷酸（nadh）的氧化反应，即采用光度法测定其氧化后峰值的变化，以分析细胞裂解样品中cdk1/cyclin b特异活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或纯化酶样品中cdk1/cyclin b激酶的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
技术背景
细胞周期素依赖性激酶1（cyclin dependent kinase 1；cdk1），又称为细胞分裂周期蛋白2（cell division cycle2；cdc2）或p34cdk1，属于激酶（serine/threonine protein kinase）家属成员之一。其为高度进化保留的激酶复合物，成熟促进因子（maturation promoting factor；mrf）中的催化亚体，含有297氨基酸，与细胞周期素b结合，允许细胞由g2期进入有丝分裂期以及由g1期进入dna合成期，达到调节细胞生长、dna复制、细胞分裂等。其磷酸化目标序列为gggrspgrrrrk。基于底物gggrspgrrrrk，在atp的存在下，受到cdk1/cyclin b激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；pk）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；ldh）反应系统中，还原型腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；nadh）转化为氧化型腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；nad），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析细胞周期素依赖性激酶1/细胞周期素b的特异活性。其反应方式为：
产品内容
清理液（reagent a） 毫升
裂解液（reagent b） 毫升
缓冲液（reagent c） 毫升
酶促液（reagent d） 微升
反应液（reagent e） 微升
底物液（reagent f） 微升
阴性液（reagent g） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液（reagent a）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月
用户自备
cdk1/cyclin b激酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
100微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析
实验步骤
一、待测样品准备
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 x 106细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（reagent a），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用消化）
5．加入xx毫升清理液（reagent a），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（reagent b），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000rpm，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1．准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里
2．设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
三、背景对照测定
1．移取65微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入10微升酶促液（reagent d）
3．加入10微升反应液（reagent e）
4．加入10微升底物液（reagent f）
5．放进30℃培养箱里静置3分钟
6．加入5微升阴性液（reagent g）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数5分钟
四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入xx微升酶促液（reagent d）
3．加入xx微升反应液（reagent e）
4．加入xx微升底物液（reagent f）
5．放进30℃培养箱里静置3分钟
6．加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数5分钟
关键词：培养箱 酶标仪 离心机 台式离心机