硬组织的病理观测对于研究骨骼、牙齿等器官疾病的发展具有很重要的意义。但是硬组织由于其本身硬度大难以被传统的薄片切割机直接切割，因此在切割之前往往需要脱钙处理，使其软化以达到刀片所能够承受的硬度范围内进行切割。但是钙质作为骨骼和牙齿的组成部分，进行脱钙将不可避免的丢失所研究器官中的信息，尤其是在含钙量高的牙釉质等部位中。同时，钙在早期硬组织愈合如牙质修复、骨创伤愈合等过程中也起着重要作用。另外脱钙还不可避免的改变了硬组织的形貌，诸如厚度变化、褶皱、软硬组织分离等问题。因此寻找无需脱钙的切割方法对于研究硬组织研究是十分必要的。
随着激光技术的发展，这一难题有望得到解决。对于刀片切割来说，受到刀片材料本身的限制，无法切割比刀片更硬的物体，但是这个困难在激光切割中并不存在 。然而激光切割也有其缺点：首先作为一种高能光束，其本身蕴含的能量较高容易灼伤物体表面，从而影响切割效果；另外受到激光在穿透物体时将不可避免的被所穿透物体中的组分散射，从而限制了激光切割的深度。近几年发展较为迅速的双光子聚焦技术给激光3d切割带来了新的可能。
双光子切割具有如下优势：首先双光子能够穿透一定深度的样品，因此能够直接在物体内部进行切割，进而实现对组织深层区域的切割；其次双光子的聚焦点能够控制，可实现以往切割设备不能实现的3d切割；另外双光子一般采用近红外激光作为激发光源，这类激光往往拥有杰出穿深并且对于蛋白的吸收较低，基本不会灼伤样品。后双光子切割相比于传统打磨方法来说更为，样品的损失更少。
在制样上来说，双光子切割也十分的简单。根据目前文献上主要采用的方法可以总结为：首先使用甲醛固定，然后使用pmma包埋，接下来使用双光子激光切割设备切割，经过简单打磨后，就可以染色压片了。这比起传统的硬组织切割步骤更为简单，制备时间更短。并且制备效果比传统方法更优。
双光子切割实际效果图精选观察骨组织的修复过程
激光切割人体第四腰椎垂直切片前部。c. sem; d. plm; e. sem + plm。从图中可以清晰看到骨组织表面修复。
观察基因缺陷对骨组织的影响
小鼠胫骨的sem图像。a.phospho1敲除（ko）的胫骨近端显示非矿化基质类骨；b. 胫骨骨干。白色箭头显示骨髓内表面的骨样斑块。黑色箭头显示位于皮质血管的骨样区（向下至20-50 lm区域）的大小变化；c. 膝盖。致密纤维结缔组织骨膜位于白色箭头处；d.wt的对照关节。
观察手术后的骨组织再生
节段性缺损愈合的组织形态学评价。a-d。safranin orange/von kossa染色观测修复手术愈合效果的胫骨代表性图片，la，外侧；me，内侧；pr，近端；di，远端，对侧钢板。e.手术后一周内采集的对照样本作标本图片。自体松质骨移植（abg）对蜂巢的增强作用黑色（蓝色星）和支架中心孔内明显的截骨术血肿（白色星）仍然可见。
牙齿病理观测
大鼠牙本质切片观测 人牙齿切片观测
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