一、实验材料:疾病对应的细胞系(或者是原代细胞),预算充足情况下可以选择2种细胞系,暂定为:a和b细胞
二、实验方案:敲低两种细胞的目的基因1、过表达两种细胞的目的基因1(若是mirna可以使用mimics、inhibitor)
三、干扰片段筛选:2种细胞都需要筛选(当用mimics和inhibitor时也需要初步筛选表达效果)
目的基因1干扰片段筛选:针对目的基因1设计并合成3条sirna及nc,转染细胞,qpcr筛选出干扰 的片段进行后续实验;
四、实验分组:a或b细胞
a
a+sirna nc对照组
a+sirna目的基因1干扰
a+过表达目标基因1
a+过表达空载
抑制剂处理浓度1
五、检测项目:
细胞增殖或者细胞毒性检测(cck法/mmt),
流式检测细胞周期,
流式检测细胞凋亡,
细胞侵袭实验(transwell),迁移、划痕
wb检测细胞信号通路中蛋白的表达变化,
qpcr检测信号通路中基因的表达,
免疫荧光检测下游信号通路蛋白
流式多色检测某些marker指标
coip检测a和b蛋白是否结合
双荧光素酶检测a和b是否结合
油红o染色
生化检测:sod,cat等
透射电镜