摘要： 质量控制是中药 (tcm) 行业中重要的任务之一。在质量控制中，要求用 hplc 方 法测定 tcm 中主要化合物的含量。鉴于 tcm 样品的复杂性，目标化合物有可能与 其他微量化合物在 hplc 分离中发生共洗脱。二维液相色谱是一个采用正交色谱柱 化学键合相和流动相的强大方法，该方法可分离复杂样品。本应用简报详述了如何 开发用于翼首草 (pterocephali herbra) 中*和熊果酸定量分析的高分辨率采样 二维液相色谱方法。
前言 中药 (tcm) 分析是一项挑战的任 务，因为无论是一种草药还是复方制剂， 含有的成分都非常复杂。为控制 tcm 的 质量，需要使用《中国药典》(chp) 中规 定的 hplc二维液相色谱 方法测定其中主要化合物的含 量。通常来说，其他化合物将与目标化合 物发生共洗脱，从而影响定量准确度。 在《中国药典》中，翼首草是一个需要 用 hplc 方法测定*和熊果酸（图 1）两种目标化合物含量的示例。本研究 发现，其他几种化合物会与*和熊 果酸发生共洗脱，使现有方法不足以对这 些化合物进行定量分析。
为实现正交分离，本应用简报使用两根选 择性不同的 agilent infinitylab poroshell 120 色谱柱（ec-c18 和 phenyl-hexyl）， 并在高分辨率采样二维液相色谱中采用了 不同的流动相条件。在选定时间范围内收 集几个涵盖一维色谱图中整个峰面积范围 的小体积馏分，以此测定两个目标化合 物。每次切割都驻留在采样环中，并在第 二维中对所有切割进行连续分析。这一模 式可确保所有选定化合物均转移至第二 维，并在其中得到分析。因此，选定的共 洗脱化合物都接受了高分辨率采样处理， 以在第二维中得到分析。如之前出版的技 术概述1 所示，这一操作可实现可靠的定 量分析。
实验部分 化学品和样品 所有试剂和溶剂均为 hplc 级。乙腈和 甲醇购自 jt baker, usa。乙酸铵购自 北京百灵威科技有限公司。新制超纯 水产自 elga 水纯化系统，lane end, uk。翼首草提取物以及*和熊 果酸对照品由中国当地一家制药公司提 供。将*和熊果酸同时溶于甲醇 中配制储备标准溶液，二者浓度分别为 2.3 mg/ml 和 2.0 mg/ml。 仪器 agilent 1290 infinity ii 二维液相色谱包括 以下模块： • 两台 agilent 1290 infinity ii 高速泵 (g7120a) • agilent 1290 infinity ii multisampler (g7167b)，配备样品冷却装置（选 件 #100） • 两台 agilent 1290 infinity ii mct (g7116b) • 两台 agilent 1290 infinity ii dad (g7117b)，配备 10 mm 大光强 卡套式流通池 (g4212-60008) 和 60 mm 大光强卡套式流通池 (g4212- 60007) • agilent 1290 infinity 阀驱动 (g1170a) 和 2 位/4 通双向阀（二维 液相色谱阀头，g4236a） • 两个 agilent 1290 infinity 阀驱动 (g1170a)，配备带 40 µl 定量环的 多中心切割阀 (g4242-64000)
高分辨率采样方法设置 高分辨率采样方法设置参考了之前发布 的技术概述1 。图 3 显示 agilent 1290 infinity ii 二维液相色谱的高分辨率采样配 置，包括 2 位/4 通双向阀，与带有 12 个 定量环的多中心切割阀相连。采用这一设 置后，多可对 10 次连续切割进行采样 与储存以待分析。对于高分辨率采样，为 避免发生任何样品损失，建议定量环充填 量大为 80%。图 4 显示了二维泵的使 用方法设置。首先，运行一维液相色谱分 离样品，并将色谱图加载为参比信号预览 窗口。基于时间高分辨率采样以目标峰为 依据，8 次切割涵盖了整个峰宽。在给定 一维条件下，采样时间为 8.63 秒，相当 于 72% 的定量环填充。
结果与讨论 分离 图 5 显示采用根据 chp 方法的优化方 法，对翼首草中的*和熊果酸进行 分析得到的典型色谱图。在这一方法中， 采用 infinitylab poroshell 120 4 µm 为对 照品提供了良好的分离度，而样品极其复 杂，因此目标分析物未能与其他干扰化合 物实现充分分离。因此，使用传统一维液 相色谱分离无法对目标分析物进行定量 分析。 使用高分辨率采样二维液相色谱可将这两 种目标化合物从干扰化合物中分离，实现 正确的定量分析。利用不同选择性的色 谱柱化学键合相可达到这一目的。在 2.7 和 1.9 µm 表面多孔颗粒填料上引入多 种化学键合相，使 infinitylab poroshell 120 色谱柱成为实现二维 hplc 分离所 需正交分离的选择。该方法使用 phenyl-hexyl 色谱柱作为。齐墩 果酸和熊果酸两种目标化合物在 agilent infinitylab poroshell 120 phenyl-hexyl, 2.1 × 100 mm, 1.9 µm 色谱柱上实现了 基线分离，如图 6a 所示。亚 2 µm 表面 多孔颗粒填料 poroshell 色谱柱对两个窄 峰宽化合物表现出高柱效和良好的分离度，使二维分离采样更轻松。第二维分 离使用 agilent infinitylab poroshell 120 ec-c18, 3.0 × 50 mm, 2.7 µm 色谱柱。这 款色谱柱反压低，可采用高流速使目标化 合物与共洗脱化合物实现快速分离。使 用高分辨率采样，对包含*和熊 果酸色谱峰的时间范围进行 8 次切割采 样（图 6a），并进样至第二维进行分析 （图 6d）。