气血理论是中医基础理论之一，由于气虚原因出 现血不循经、溢出脉外的情况被称为气不摄血证。气 不摄血证常见于现代医学中免疫性血小板减少症 （immune thrombocytopenia，itp）、再生障碍性贫 血、脓毒症、上消化道出血等疾病，尤以 itp 气不摄血证研究较多。现代研究显示，itp 是由自身 免疫系统介导的血小板计数暂时或持续减少的临床 常见的出血性疾病之一。以往对 itp 的研究多集中在 免疫系统方面，然而临床上部分 itp 患者出现血小板 计数重度减少，并未出现明显出血症状，出现上述 情况可能是由于血管内皮损伤的程度不一。
1 实验材料
1.1 动物
健康 spf 级 balb/c 小鼠，雌雄各半，8 周龄，体质量 18～22 g，北京维通利华实验动物技术有限公 司，动物生产许可证号 scxk（京）2016-0006，动物 质量合格证号 11400700313965、11400700319519、 11400700311207、11400700311181；健康普通级豚鼠， 雌性，8 周龄，体质量 200 g，北京芳元缘养殖场，动 物生产许可证号 scxk（京）2014-0012，动物质量合 格证号 11804900011954；健康 spf 级 balb/c 小鼠， 雄性，8 周龄，体质量 18～22 g，北京维通利华实验 动物技术有限公司，动物生产许可证号 scxk（京） 2016-0006，动物质量合格证号 11400700335844。饲 养于中国中医西苑医院实验动物中心 spf 级 实验动物室，温度 20～26℃，相对湿度 40%～70%， 昼夜 12 h 交替，自由摄食饮水。饲料由北京科澳协力 饲料有限公司提供，饮用水为灭菌水，每日更换。
1.2 试剂
acd 抗凝剂（a），北京百奥莱博科技有限公司， 批号 0511a18；*，国药集团化学试剂有限公 司，批号 t；弗氏*佐剂（fca），美国 sigma 公司，批号 slbp0432v；弗氏不*佐剂 （fica），美国 sigma 公司，批号 slbs4985；pbs， 北京索莱宝科技有限公司，批号 ；小鼠 vwf elisa 检测试剂盒，北京安迪华泰科技有限公司，批 号 ht20378；小鼠 no elisa 检测试剂盒，andygene 公司，批号 ht20367；小鼠 et-1 elisa 检测试剂盒， 北京安迪华泰科技有限公司，批号 ht20379；小鼠 aimplex 流式高通量多因子 vegf-a、sicam-1、 svcam-1 检测试剂盒，北京旷博生物技术有限公司， 批号 。
1.3 仪器
全自动（nihoh kohden 公司， mek-6318k），电子天平（长沙湘平科技发展有限公 司，es-1100；北京赛多利斯仪器有限公司，tp-213）， 流式细胞分析仪（bd 公司，calibur），高速冷冻离心 机（赛默飞世尔科技公司，cl31r），大小鼠抓力测 定仪（济南益延科技发展有限公司，yls-13a），酶 标仪（labsystems multiskan ms，352）， （北京白洋医疗器械有限公司，by-160a），涡旋器 （其林贝尔仪器制造有限公司，其林贝尔ql-861）。
2 实验方法
2.1 豚鼠抗血小板血清制备
①制备抗原：取 balb/c 小鼠，雌雄各半，3.5% *腹腔注射麻醉，摘出眼球取血，acd（a） 抗凝，200×g 离心 10 min。取上层富含血小板血浆， 1700×g 离心 10 min，去上清液，0.1 mol/l、ph 7.4 pbs 冲洗血小板 3 次，调整血小板数 2×109 /l。②免疫：将 血小板分别与等量 fca 和 fica 混合，成油包水状， 为 fca 抗原和 fica 抗原。取 fca 抗原，于 0 周注射 豚鼠足掌、背及皮下，共 5 点，每点 200 μl，共 1000 μl。 取 fica 抗原分别于 1、2、4 周在上述相同部位注射。 第 5 周豚鼠腹主动脉取不抗凝全血，室温放置 1 h， 3500 r/min 离心 10 min，取上清液，置于-30 ℃冰箱 储存。③红细胞吸附：将 aps 从-30 ℃冰箱中取出， 置于 56 ℃水浴中 30 min 灭活补体。将等体积 5%balb/c 小鼠红细胞悬液加到 aps 中，37 ℃孵育 1 h，3500 r/min 离心 10 min，取上清液，上清液再按 上述方法吸附 2 次，即稀释成 1∶4 浓度，备用。
2.2 造模
在前期研究基础上，采用睡眠剥夺复合免疫方 法进行造模。睡眠剥夺：将小鼠置于自制水平台 （水平台规格：平台高 40 mm、底盘直径 60 mm、中 间竖管直径 10 mm、顶盘直径 25 mm）上，每笼 4 个 水平台，放置 3 只小鼠。使用铁丝网将睡眠剥夺笼盖 住并固定，保证小鼠无法逃脱，但可以移动。食物与 饮用水瓶置于铁丝网食槽内，使小鼠可自由摄食饮 水，若小鼠进入睡眠状态，会因肌肉松弛而落入水中， 从而使小鼠始终保持清醒状态。采取随机时间段剥夺 方法，平均每日剥夺 19 h。每日剥夺结束后，将小鼠 取出，放回鼠笼。免疫：按 100 μl/20 g 腹腔注射 aps， 隔日 1 次，共注射 7 次。造模：第 1 周进行睡眠剥夺， 第 2、3 周睡眠剥夺复合注射 aps 免疫。
2.3 分组
将雄性 balb/c 小鼠分为正常组和模型组，各组再分为 7、10、21 d 共 3 个时间点，正常组每个时间 点各 10 只，模型组每个时间点各 12 只。模型组睡眠 剥夺 7 d 后，在睡眠剥夺同时，每隔 1 d 注射 aps； 正常组每隔 1 d 注射生理盐水。每个时间点结束后， 小鼠摘眼球取血，常规制备血清，-80 ℃冰箱贮藏备 用，进行相应指标检测。
2.4 检测指标
2.4.1 小鼠体征
观察小鼠精神状态、毛色、大便、出血情况等。
2.4.2 体质量
测量小鼠体质量。
2.4.3 抓力
使用大小鼠抓力测定仪测定小鼠抓力。
2.4.4 血小板计数
取小鼠尾静脉血，使用全自动测量 血小板数量。
2.4.5 脏器指数
小鼠麻醉，取脾脏、胸腺，生理盐水冲洗后称重。 计算脏器指数。脏器指数（%）＝脏器湿重（g）÷ 小鼠体质量（g）×100%。
2.4.6 elisa 检测
血清血管性血友病因子、一氧化氮 和内皮素-1 含量 -80 ℃冰箱取出小鼠血清，按 elisa 试剂盒说明 书进行操作，检测小鼠血清 vwf、no、et-1 含量。
2.4.7 流式法检测
血清血管内皮生长因子-a、可溶性 细胞间黏附分子-1、可溶性血管细胞黏附分子-1 含量 -80 ℃冰箱取出小鼠血清，按 aimplex 流式高通 量多因子检测试剂盒说明书进行操作，检测小鼠血清 vegf-a、sicam-1、svcam-1 含量。
3 统计学方法
采用 spss20.0 统计软件进行分析。实验数据以 — x±s 表示，组间比较用独立样本 t 检验。p＜0.05 表示 差异有统计学意义。
4 结果
正常组小鼠精神状态良好，反应敏捷，活动性良 好，毛色纯白有光泽，大便呈黄褐色，条状，颗粒清 晰。第 7 日模型组小鼠精神状态萎靡，反应迟钝，每 日停止睡眠剥夺后，倦怠蜷缩，极少活动，毛色黯黄 粗糙，大便呈黑褐色或黄色，便稀，随时间延长日益 加重。第 10 日（注射 aps 后 3 d），小鼠腹部、腿部 出现出血点，便血情况出现，第 2 次注射后， 小鼠出血严重，此后逐日减轻，第 21 日已无出 血情况。
5 讨论
气是构成人体和维持人体生命活动的精微物质， 血为脉管中流动的红色液体，二者相互作用，保证人 体机能的正常运行。在中医理论中，血证有广义与狭 义之分，其中广义的血证是指与血液有关的疾病，狭 义的血证是指由于各种原因导致的血不循经，溢出脉 外。气不摄血是血证的常见病机，其辨证要点为出血 和气虚。由于气的统摄作用，血液才可循行脉中，若 气虚无法统摄，血溢脉外，则会出现各类出血。
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