细胞培养生物污染鉴别、清除及控制方法生物污染是指如细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体和其他类型的细胞都可能侵入细胞培养环境引起污染。
生物性污染对细胞代谢的影响，可因污染源和细胞的种类不同而表现各异。
一、污染的类型
1.细菌污染
•培养物通常呈云雾状（即浑浊状），有时表面会覆盖一层薄膜
•ph突然降低•高倍镜下可分辨出细菌的形状
2.霉菌污染
•培养物浑浊
•污染初期ph值稳定，严重后ph值迅速升高
•显微镜下通常呈细束状纤维，或较为密集的孢子团块
3.酵母污染
•培养基变浑浊，尤其是污染后
•一般ph值变化很小，严重时ph值升高
•显微镜下呈卵圆形或球形颗粒，有些会芽生较小颗粒
4.支原体污染
•体积较小（一般＜1um），导致难以发现
•细胞增殖速度降低，饱和密度下降，悬浮培养物聚集
•定期检测培养物（支原体检测试剂盒）
5.病毒污染
•体积极小，检测及去除十分困难
•常常因为观察到细胞生长和形态发生改变而发现
•会对实验室工作人员造成严重的健康威胁
•使用质量好的血清产品降低病毒污染的风险
6.非同种细胞污染
•由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染
二、污染的鉴别
（一）细菌、真菌污染的检测
1.肉眼观察细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到
2.接种观察采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染
3.培养物被细菌污染后，几天内即可通过简单的肉眼观察发现，被感染的培养物通常呈云雾状(即：浑浊状)，有时表面会覆盖一层薄膜。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染
（二）支原体污染的检测
1.荧光染色法观察用荧光染料与dna特异地结合，可使支原体内的dna着色，荧光显微镜下支原体成绿色小点，散于细胞周围或附于细胞表面。
2.电镜检测若条件许可，可用扫描电镜或投射电镜观察。一般在细胞培养48-72小时，细胞接近汇合前，用胰，酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察4.培养检测将细胞悬液5ml加入45ml支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养基有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。
（三）病毒的检测
1.应用电镜技术快速诊断动物病毒病
2.逆转录-聚合酶链式反应rt-pcr检测病毒
三、污染的清除
培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之;在寻找原因后彻，底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取如下办法清除。
（一）细菌和真菌的清除
1.使用抗生素抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好预防用药一般用双抗生素，污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加后作用24～48小时，再换常规培养液，此法在污染早期有效。
（二）支原体的清除
1.用mra处理用mra（mycoplasma removal agent）处理细胞，每4天换一次液，连续处理15以确保细胞纯洁健康，效果好。
2.用清洗纯化法清除支原体污染的方法细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至，极限。如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。
3.药物辅助加温处理先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养4-5小时，最长不超过18小时，可杀死支原体，但对细胞也有不良影响。
4.使用支原体特异性血清此方法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。
四、污染的控制
通过一套操作流程降低培养物被上述污染源污染的可能，即无菌操作技术
1.无菌工作区域
•常规清洗地面和台面
•定期清洁水浴锅
•co2培养箱定期清洗、消毒和擦
•生物安全柜每次使用后清洁及消
2.良好的无菌操作
•所有玻璃器皿和培养液与试剂的配制应严格无菌
•避免溢出、溅出和气溶胶；
•吸入或吸出液体时避免倾倒
•吸入或吸出液体时，不要触碰细胞培养瓶的瓶口；
•液体应分装并置4-8℃保存；
•每种细胞应使用单独的液体
•清洁区和污染区的材料应单独处理
3.合理利用抗生素
•过度依赖抗生素会使人们忽略无菌操作
•滥用抗生素常导致耐药菌的产
•牢记抗生素不能代替无菌操
4.建立细胞库
•减少从主管单位获得细胞的运输
•冻存的细胞生物性状不发生改
•消除了隐蔽污染的潜在危
5.良好的规章制度
•只有相关人员才可进入细胞培养区
•细胞培养区必须和其他区域分开
•每个细胞培养区应布局合理，保证所需物品就近放置，在处理细胞时避免不必要的走动
•细胞培养区应避免使用水池，从而避免微生物污染