通用名称：副猪嗜血杆菌检测试剂盒（实时荧光pcr法）
英文名称：haemphilus parasuis detecting kit (real-time pcr method)
【包装规格】25t/盒＆50t/盒
【预期用途】
副猪嗜血杆菌(haemophilus parasuis,hps)是猪上呼吸道一种常在菌,在一定条件下可引起严重的全身性疾病。本试剂盒利用实时荧光pcr原理，主要用于hps的定性筛查检测。
【检验原理】
本试剂盒针对副猪嗜血杆菌肺炎基因设计特异性引物和探针，在反应体系中含有副猪嗜血杆菌dna模板的情况下，pcr反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对pcr过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
【主要组成成份】
序号
组成
25t/盒
50t/盒
1
hpspcr反应液
437.5μl×1管
875μl×1管
2
hps混合酶液
62.5μl×1管
125μl×1管
3
hps阳性对照
40μl×1管
40 μl×1管
4
hps阴性对照
40μl×1管
40 μl×1管
5
说明书
1份
1份
注：阴性对照为不含hps核酸的其它菌的混合物，阳性对照为hps经灭活处理的核酸提取物。
【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。
【适用仪器】abi 系列、bio-rad系列、agilent stratagene mx系列、roche lightcycler r480、cepheid smartcycler、rotor-gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量pcr仪。
【样本要求】
1. 样本要求：标本（*、菌落、菌苔等）应为新鲜采集并使用双蒸灭菌水或灭菌生理盐水悬浮的原始标本，或心包液、胸腹腔积液、关节液等无菌收集数毫升，或取少量肺脏样品（2～3克）研磨后入无菌离心管中，3000 rpm 离心10分钟取上清待检。
2. 标本收集后若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需*保存，标本应冻存于-20℃～-80℃。
3. 标本保存期间应避免反复冻融。
【检验方法】
1.试剂准备（试剂准备区）
（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
（2）核算当次实验所需要的反应数（n），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数（1t）+阳性对照数（1t）+误差预留量（1t）+样本数
单反液配制表(每份)
pcr反应液
17.5 μl
混合酶液（taq酶+ung酶）
2.5 μl
(3)在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μl/管分装量将试剂分装至pcr反应管。
(4) 盖紧pcr反应管盖后将pcr反应管和试剂盒中的dna提取液转移至样本处理区。剩余试剂放回-20℃以下冰箱冷冻保存。
2.样本准备（样本处理区）
用qiagen、roche公司*提取dna，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
在上述制备好的pcr反应样本管中分别加入处理好的待测标本dna各5μl、终体积25μl/管，盖好pcr反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到pcr仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5μl试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25μl/管，盖好pcr反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到pcr仪器上。
4.pcr（pcr扩增区）
（1）取样本处理区准备好的pcr反应管，放置在实时荧光定量pcr仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行pcr扩增。
反应体积
25 μl
通道选择
fam通道采集hps荧光信号
pcr
反应
条件
步骤
条件
循环数
ung处理
50℃：2分钟（min）
1
预变性
95℃：3分钟（min）
1
预扩增
95℃：5秒（s）
5
55℃：40秒（s）
pcr扩增
95℃：5秒（s）
40
55℃：40秒（s）
（此阶段结束时采集荧光信号）
注：abi系列荧光pcr仪在设置时不选rox校正，设置淬灭基团选择none。
【参考值（参考范围）】
1.试剂盒有效性判定：
（1）阳性对照：有典型s型扩增曲线或ct值≤35。
（2）阴性对照：ct值＞38或无ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增*。
2.标本结果判定：
（1）阳性：标本检测结果ct值≤35或有明显指数增*。
（2）可疑：标本检测结果ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果ct值仍在35～38范围内，有明显指数增*，则判定为阳性，否则为阴性。
（3）阴性：标本检测结果ct值＞38或无ct值。
【检验结果的解释】
通道及检测结果
标本检测结果解释
fam
阴性（－）
标本中未检出hps
阳性（＋）
标本中检测出hps
【检验方法的局限性】
当检测样本中被检核酸浓度含量低于本试剂盒的zui低检出*可能会发生假阴性的结果。本试剂盒仅供标本初步筛查使用，对于本试剂盒检测阳性结果应进一步使用培养法进行确诊。【产品性能指标】产品的zui低检出限为102cfu，产品cv值≤5%。
【注意事项】
整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和pcr扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。每次实验应该设置阴、阳性对照。为保证试剂不受标本污染，必须将混合酶液及pcr反应液保存于试剂准备区。试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。试剂盒内所配阴性和阳性对照在*次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触pcr反应管，并应避免在pcr反应管上进行任何标记。仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。abi系列荧光定量pcr仪参数设置中不选rox校正，淬灭基因选择none。实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。