pcr反应循环参数剖析:
1.预变性
模板dnawan全变性与pcr酶的wan全激活对pcr能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的taq酶激活时间为两分钟。
2.变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶dna序列wan全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻di，易造成扩增失败。
3.引物退火
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对pcr的特异性有较大影响。
4.引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
5.循环数
大多数pcr含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6.最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸wan全，并使单链产物退火成双链。