1、变性温度与时间
模板变性温度是决定pcr反应中双链dna解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链dna模板，pcr也就不会启动。变性温度低则变性不wan全，dna双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性，一般情况下可设为94℃ 20-30秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热dna聚合酶的活力，最高变性温度不宜超过95℃。
2、退火温度与时间
退火温度决定pcr特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，dna扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45-68℃之间。设置特定反应的最适退火温度，可根据引物的（g+c）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度tm低5℃，退火时间一般为30-60秒，足以使引物与模板之间结合，没有必要长时间退火。
3、延伸温度与时间
pcr反应的延伸温度一般选择在70-75℃之间，延伸时间根据所有聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定。如同样扩增2kb片段，若使用taq酶只需要1分钟，使用pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。
4、循环次数
可根据模板dna的量，扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设定30-40个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。