简介
使用半固体培养基（软琼脂或人工基底膜）中的细胞培养物进行的细胞转化/致瘤性检测已经在肿瘤研究中得到很好的运用。该检测要求细胞以一种不依赖锚定的方式生长，这是肿瘤细胞的标志。与2d 单层培养的贴壁细胞相比，3d 生长条件被认为可更准确地反映肿瘤细胞的自然环境，并跨越2d 培养物和动物研究之间的差距3，5。重要的是，3d 检测比动物的致瘤如小鼠异种移植模型相关性更好。人们对开发个体化医疗方法的兴趣日益浓厚，在这些方法中，对个体患者的肿瘤细胞进行了一组药物敏感性检测4，这导致了对相关性和时效性研究的更高需求。
由于菌落的主观定义，3d 检测以前是劳动密集型的且不一致的，不适合高通量筛选。在这项研究中，我们描述了一种与高通量筛选兼容的方法，其中使用高内涵成像和3d 分析检测和定量化合物对半固相培养基中细胞生长的影响。
适用于筛选的实验方案
为了在半固相培养基中制备细胞球培养物，将人结肠癌hct116 细胞与在生长培养基中稀释的4.25 mg/ml 冷基质胶（corning）溶液预先混合，并以500细胞/孔，总体积为25 µl的密度铺板至96 孔半面积板（greiner）中。将板在37°c 下孵育30 分钟以固化凝胶，然后添加25 ml 培养基。在24-48 小时内，每个孔中均形成细胞球克隆。
用抗肿瘤化合物处理细胞球培养物5 天。将化合物以2x 浓度在培养基中稀释，并将25 ul的6 点稀释系列添加到一式三份孔中。在第3 天，我们通过用1x 化合物稀释液交换一半培养基来添加新鲜化合物。在用测试化合物处理结束时，用两种染料的混合物对细胞进行染色：最终浓度1 µm calceinam 和5 µm hoechst 33342 （life technologies）。以3x 浓度制备染料溶液，直接添加到培养基中，无需吹打，并在成像前孵育2 小时。在另一种检测中，使用4% 甲醛溶液将细胞固定1 小时，每次去除一半体积，用pbs 洗涤3 次。然后用5 µm hoechst 33342 和0.06 µm alexafluor-488 phalloidin （life technologies）对细胞进行染色。
优势
对细胞球进行高通量筛选，以实现高效和一致的采集
定量和测量更具生理相关性的模型的特征
使用集成软件解决方案缩短分析时间
集成共聚焦成像和3d 分析
使用imagexpressmicro confocal 共聚焦高内涵成像系统（molecular devices）采集图像，其中20xplan fluor 或10xplan fluor 物镜（图1）。使用5-10 µm 间隔的11-20 个z 层获得100-150 µm 的z 堆叠范围（10 倍物镜）或2-5 µm（20 倍物镜）。每个孔拍摄两个视野，所有单独的z 层以及每个z 堆叠的2d 最大投影图像都被保存用于3d 分析（图2）。
图1：用hoechst 和af488-phalloidin染色的基质胶细胞球的最大投影图像。
图2. matrigel 中细胞球的z 平面。用hoechst 和af488-phalloidin 对细胞球进行染色。指示与孔底的距离。
使用metaxpress高内涵图像采集和分析软件的自定义模块编辑器中的3d 分析模块分析图像。根据大小和强度定义细胞球和单个细胞。然后，细胞球大小和表型的特征是细胞标记的体积、直径和荧光强度。使用自定义分析模块（图3）生成多参数输出，每个细胞球的读数包括核计数、大小、体积、强度、每个细胞球的活细胞、全细胞体积和直径、细胞球直径以及细胞标记物（calceinam、phalloidin 或hoechst）的平均强度的测量值。上述读数可按单个对象（细胞球）报告，或按孔平均值报告。每孔可采集额外的视野以增加评价的细胞数量。使用4 参数曲线拟合确定ic50值（图4）。
图3. 使用metaxpress自定义模块编辑器定义细胞球。（a）计数核和（b）细胞分类模块定义了每个目标标记物的细胞球计数和单个细胞评分。
•阿糖胞苷
•多柔比星
•顺铂
•氟腺嘌呤
图4. 选定化合物的浓度-反应。在3d 体积内计算（a）细胞球/孔数量、（b）活细胞/孔数量和（c）活细胞/细胞球总体积的测量值。
化合物
ic.，um
紫杉醇
0.036 +/- 0.021
阿糖胞苷
0.43 +/- 0.011
星孢菌素
0.169 +/- 0.017
丝裂霉素c
0.177 +/- 0.102
多柔比星
1.22 +/- 0.411
依托泊苷
2.13 +/- 0.42
顺铂
56.1 +/- 14.1
氟腺嘌呤
129 +/- 41.2
表1 使用每个孔的细胞球数量和读数测量选定化合物的ic 值。