通用名称：禽流感病毒h7n9亚型检测试剂盒（双色实时荧光pcr法）
英文名称：avian influenza virus h7n9 subtypedetection kit (dual channel real-time pcr method)
【包装规格】 25头份/盒 & 50头份/盒
【预期用途】
本试剂盒利用实时荧光pcr原理，定性检测禽流感病毒h7n9亚型（aiv-h7n9），对aiv-h7n9引起的禽流感的诊断和监控具有重要指导意义。
【检验原理】
本试剂盒针对aiv-h7n9高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含aiv-h7n9基因组模板的情况下，pcr反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对pcr过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
【主要组成成份】
序号
组成
25头份/盒
50头份/盒
1
aiv-h7n9rt-pcr反应液
375μl×1管
750 μl×1管
2
aiv-h7n9逆转录酶
50μl×1管
100 μl×1管
3
aiv-h7n9taq酶
75μl×1管
150μl×1管
4
aiv-h7n9阳性对照
40 μl×1管
40 μl×1管
5
aiv-h7n9阴性对照
40 μl×1管
40 μl×1管
6
说明书
1份
1份
注：阴性对照为禽类基因组dna，阳性对照为失去活性的aiv-h7n9病毒cdna。
【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反复冻融,有效期12个月。
【适用仪器】abi 系列、bio-rad系列、agilent stratagene mx系列 、roche lightcycler r480、cepheid smartcycler、rotor-gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量pcr仪。
【样本要求】
1.样品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：
咽喉拭子，采取时要将拭子深入喉头及上颚裂来回刮3次～5次，取咽喉分泌液；将咽喉拭子放人盛有1.0ml生理盐水的离心管中备用，应避免标本间交叉污染。
2.标本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过 夜保存；如需*保存，标本应冻存于-80℃，避免反复冻融。
【检验方法】
1.试剂准备（试剂准备区）
（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
（2）核算当次实验所需要的反应数（n），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数（1t）+阳性对照数（1t）+误差预留量（1t）+样本数
单反液配制表(每头份)
rt-pcr反应液
15.0 μl
逆转录酶
2.0 μl
taq酶
3.0 μl
（3）在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μl/管分装量将试剂分装至pcr反应管。
2.样本准备（样本处理区）
用qiagen、roche公司rna提取试剂盒提取rna，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
在上述制备好的pcr反应管中分别加入处理好的待测标本rna各5 μl、终体积25 μl/管，盖好pcr反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到pcr仪器上。
根据需要，在上述准备好的pcr反应管中分别加入阴性对照品以及阳性对照品各5 μl，终体积为25 μl/管，盖好pcr反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到pcr仪器上。
4. pcr（pcr扩增区）
（1）取样本处理区准备好的pcr反应管，放置在实时荧光定量pcr仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行pcr扩增。
反应体积
25 μl
通道选择
fam通道采集aiv-h7荧光信号
hex通道采集aiv-n9荧光信号
pcr
反应
条件
步骤
条件
循环数
反转录
42℃：10分钟（min）
1
预变性
95℃：3分钟（min）
1
预扩增
95℃：5秒（s）
5
55℃：40秒（s）
pcr扩增
95℃：5秒（s）
40
55℃：40秒（s）
（此阶段结束时采集荧光信号）
注：abi系列荧光pcr仪在设置时不选rox校正，设置淬灭基团选择none
【参考值（参考范围）】
1.试剂盒有效性判定：
（1）阳性对照：有典型s型扩增曲线或ct值≤35。
（2）阴性对照：ct值＞38或无ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增*。
2.标本结果判定：
（1）阳性：标本检测结果ct值≤35或有明显指数增*。
（2）可疑：标本检测结果ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果ct值仍在35～38范围内，有明显指数增*，则判定为阳性，否则为阴性。
（3）阴性：标本检测结果ct值＞38或无ct值。
【检验结果的解释】
通道及检测结果
标本检测结果解释
fam
hex
+
+
样本中检测出aiv-h7和aiv-n9
+
-
样本中检测出aiv-h7，未检测出aiv-n9
-
+
检测出aiv-n9，未检测出aiv-h7。
-
-
未检测出aiv-h7和aiv-n9。
【检验方法的局限性】
当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的低检出*可能会发生假阴性的结果。被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成rna降解而产生假阴性结果。样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染，则容易得到假阳性结果。【产品性能指标】产品的低检出限为102 copies/ml，产品cv值≤5%。
【注意事项】
整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和pcr扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。为避免rna降解，样本处理过程应在0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。每次实验应该设置阴、阳性对照。试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。试剂盒内所配阴性和阳性对照在次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触pcr反应管，并应避免在pcr反应管上进行任何标记。仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。abi系列荧光定量pcr仪参数设置中不选rox校正，淬灭基因选择none。实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。