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pcr-sscp分析的基本程序为：首先pcr扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，dna单链的迁移率除与dna链的长短有关外，更主要的是取决于dna单链所形成的构象。在非变性条件下，dna单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由dna单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的dna单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。pcr产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶dna中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异dna与正常dna区分开。由此可见，pcr-sscp分析技术是一种dna单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长dna单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。为了高灵敏特异性地显示sscp分析结果，现已发展多种pcr-sscp技术，各有其优势及适用领域。例如，可以在pcr扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷，也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。这里将重点介绍的放射性同位素pcr-sscp法。在进行pcr扩增特定靶基因序列时，利用γ-32p-atp标记引物或直接在pcr反应体系中加入α-32p-dctp进行pcr扩增，使扩增产物带有同位素标记物，然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示结果。利用引物标记或碱基掺入法使pcr扩增产物带有同位素标记物，均可使产物信号增强几个数量级。二者相比较，前者经济、扩增特异性强，多用于大样本的检测和筛选；后者操作简便，适于一般实验室开展，可用于小样本或大样本的检测和筛查。本节仅介绍同位素标记碱基掺入法。一、试剂准备⒈ pcr相关试剂⒉ α-32p-dctp⒊ 30％聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺 1g，溶于100ml ddh2o中，4 oc保存。⒋ 10％过胺配制方法：1g 过胺，溶于10ml ddh2o中，4 oc保存（可用数周）。⒌ temed（n，n，n，n’，n’-四甲基乙二胺）⒍ 5×tbe缓冲液：tris碱54g、硼酸27.5g、0.5m edta(ph 8.0) 20ml，加ddh2o至1000ml。7．变性上样液：95% 甲酰胺、0.03%二青、0.05%溴酚蓝、 20mm edta(ph 8.0)二、操作步骤⒈ pcr扩增反应总体积为10μl，在0.5ml微量离心管中加入下列反应成分：10×buffer 1μldntpmix 70μmdna模板 100ng引物及taq dna酶 依实验设计要求按比例加入α-32p-dctp 0.1μl加ddh2o至 10μl
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