摘要
微波增强的多肽固相合成（spps）可以合成具有对称赖氨酸分支的多抗原肽（maps）或多肽树枝状大分子，合成时间大幅降低，纯度提高。四分支酰基载体蛋白（acp）肽的合成在2小时内完成，纯度为70%。四分支m10肽1（巴西副球孢子菌糖蛋白t细胞表位）的合成在4小时内完成，纯度为50%。在2小时内合成纯度为80%的一个八聚体，第三代赖氨酸-亮氨suan抗菌肽树枝状大分子（g3kl）2。
引言
对称分支肽（图1）代表一类具有非常理想的理化和生物学特性的肽。在一些情况下，由于与蛋白质靶标的多价结合或具有更高的蛋白酶抗性，包含分支核心的肽，如多抗原肽（maps）或肽树状聚合物有更高的生物活性3。因此分支肽已被用于各种治疗应用，包括开发抗微生物和抗病du药物4,5、肿瘤靶向剂6,7和药物输送载体8。
图1:左：对称分支的赖氨酸核心；
右：fmoc-lys(fmoc)-oh
对称分支肽的合成可通过在spps中使用fmoc-lys(fmoc)-oh来生成支链位置。合成通常比较困难，因为在分支支架上肽链固有的紧密接近性，会导致空间冲突和肽偶联不良。将微波能量应用于分支肽的合成克服了这些空间挑战，允许更有效的偶联和快速合成较少缺失的困难分支肽产物 (carbomaxtm)。9
材料和方法
试剂
以下含有特定侧链保护基团的fmoc氨基酸购自cem公司(matthews, nc)：arg(pbf)、asn (trt)、asp (otbu)、gln(trt)、his (boc)、lys (boc)、tyr (tbu) 和thr (tbu)。rink amide protide ll 树脂也得自cem 公司。fmoc-6-ahx-oh 购自anaspec (fremont, ca)。fmoc-lys(fmoc)oh 获自 creosalus (louisville, ky)。n,n'二异丙基碳二亚胺(dic)、哌啶、三fu乙suan(tfa)、3,6-二氧六环-1,8-辛二硫醇(dodt) 和三异丙基硅烷(tis) 购自sigma-aldrich (st. louis, mo)。二氯甲烷(dcm)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、无水乙mi(et2o)、乙酸、hplc级水和乙腈购自vwr (west chester, pa)。lc-ms级水(h2o)和lc-ms级乙腈(mecn)购自fisher scientific (waltham, ma)。
多肽合成：四分支acp, (vqaaidying)4-(k)2-k-ahx-kk-nh2
使用cem liberty bluetm 自动微波肽合成仪在rink amide protide ll 树脂（离子交换容量：0.19 meq/g）上以0.1 mmol 规模（树脂规模：0.025 mmol）制备肽（下图）。用哌啶和oxyma pure 在dmf 中进行脱保护。在 dmf (carbomax)9中，五倍过量的fmoc-aa 与dic 和oxyma pure 进行偶联反应。fmoc-lys(fmoc)-oh 用于分支位置的k。使用带有 tfa/h2o/ tis/dodt 的cem razortm 高通量肽切割系统进行切割。切割后，用无水乙mi沉淀肽并冻干过夜。
tetra-branched acp
多肽合成: 四分支m10, (liaihtlairyan)4-(k)2-k-ahx-kk- nh2
使 用 cem liberty bluetm 自 动 微 波 肽 合 成 仪 在 rink amide protide ll 树 脂（离 子 交 换 容 量 ：0.19 meq/g）上 以 0.1 mmol 规模（树脂规模：0.025 mmol）制备肽（下图）。用哌啶和 oxyma pure 在dmf 中进行脱保护。在 dmf 中 5 倍过量的fmoc-aa 与dic 和oxyma pure 进行偶联反应( carbomax)9。fmoc-lys(fmoc)-oh 用于分支位置的k。使用带有 tfa/h2o/tis/dodt 的cem razortm 高通量肽切割系统进行切割。裂解后，用无水乙mi沉淀肽并过夜冻干。
tetra-branched m10
多肽合成：g3kl 八聚体, (kl)8-(kkl)4-(kkl)2-kkl-ah-kk-nh2
使 用 cem liberty blue 自 动 微 波 肽 合 成 仪 在 rink amide protide ll 树脂（离子交换容量：0.19 meq/g）上以0.25 mmol 规模（树脂规模：0.025 mmol）制备肽（下图）。用哌啶和oxyma pure 在dmf 中进行脱保护。在 dmf 中5倍过量的 fmoc-aa 与dic 和oxyma pure 进行偶联反应(carbomax)9。fmoc-lys(fmoc)-oh 用于分支位置的k。使用具有tfa/h2o/tis/dodt 的 cem razor 高通量肽切割系统进行切割。裂解后，用无水乙mi沉淀肽并冻干过夜。
g3kl octamer
多肽分析
在配备有 pda 检测器的 waters acquity uplc 系统上分析肽，该 检 测 器 配 备 acquity uplc beh c8 柱（1.7mm 和2.1×100mm）。uplc 系统连接到waters 3100 single quad ms 用于结构测定。在 waters masslynx 软件上进行峰值分析。在 (i)h2o 和 (ii)mecn 中以0.05% tfa的梯度洗脱进行分离。
结果
liberty blue 自动微波肽合成仪上的使用微波增强 spps 合成四分支的acp多肽，产生了 70% 纯度的目标肽（图2）。
图2：四分支acp的uplc色谱图
libertyblue自动微波肽合成仪上使用微波增强 spps 合成在liberty blue自动微波肽合成仪上使用微波增强spps合成g3kl 八聚体产生了80%纯度的目标肽（图4）。
图3：四分支m10的uplc色谱图
图4：g3kl八聚体的uplc色谱图
结论
与传统的 spps 方法相比，使用微波增强的 spps 可以更快地制备对称分支肽，并且纯度更高。使用微波增强 spps，在2小时内合成了纯度为 70% 的四分支 acp。四支化 m10肽的常规室温合成需要超过42小时的手工劳动，目标肽的分离产率为 4%。
另一方面，微波增强的 spps 可在4小时内提供纯度为50%。g3kl 八聚体的常规合成需要超过35小时的手工劳动时间，并以 8% 的分离产率产生目标肽。2将微波能量应用于 g3kl 八聚体的合成可在2小时内以 80% 的纯度提供目标肽 。
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