一、防止rna酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% depc水浸泡或用lv 仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被lv 仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% h2o2 室温10min，然后用0.1% depc水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% depc，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的depc。不能高压灭菌的试剂，应当用depc处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置rna操作实验室，所有器械等应为。
二、常用的rna酶抑制剂
1. 焦磷酸二乙酯（depc）：是一种强烈但不*的rna酶抑制剂。它通过和rna酶的活性基团*的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是zui有效的rna酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使rna酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对rna酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和rna酶结合形成过渡态类物质，几乎能*抑制rna酶的活性。
4. rna酶的蛋白抑制剂（rnasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。rnasin是rna酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种rna酶结合，使其失活。
5. 其它：sds、尿素、硅藻土等对rna酶也有一定抑制作用。
因为depc不加选择的修饰蛋白质和rna，因此在分离和纯化rna过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如tri)不能相容。
在所有rna实验中，zui关键的因素是分离得到全长的rna。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（rna酶）的污染。
rna酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
研究人员造成的污染 rna酶zui主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行rna实验时应勤换手套。
但depc能与胺和巯基反应,因而含tris和dtt的试剂不能用depc处理。
（一）动植物总rna提取-trizol法
trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用trizol法提取的总rna*蛋白和dna污染。 rna可直接用于northern斑点分析，斑点杂交， poly(a) 分离，体外翻译，rnase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液n中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mltrizol液加入0.2ml的比例加入lv 仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mltrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。
4、弃去上清液，按每ml trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低rna的溶解度。然后将rna溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。rna可进行mrna分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。另外，提取上清这步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然会有蛋白质污染，影响比值。
2、加lv 仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，rna沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
总mrna的提取(自己的经验)
一、 关于trizol reagent需要的试剂
1． chloroform：lv 仿(分析纯)
2． isoproplyl alcohol：异丙醇(分析纯)
3． 75% ethanol（in depc-treated water）:75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的depc处理过的无rnase的水稀释。
4． rnase-free water：无rnase的水。方法是：将depc按0.01%（v/v）加在d h2o中500ml（50ul），在37℃过夜，并高压灭菌即得（150℃ 3小时）
5． 一次性塑料手套
6． 注意：depc有致癌之嫌
二、 关于trizol reagent的使用过程：
1． homogenization（匀浆）
a. tissues：组织
每100mg组织匀浆加1mltrizol试剂，样品体积不能超过trizol试剂的10%。
b. cells grown in monolayer（单层细胞接毒后出现病变的）
针对jev细胞总rna的抽提法：
bhk21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加维持液（含2%的血清和hepe8的mem）约5ml，维持天。出现75%-100%的病变时，以pbs（预冷）冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞（细胞瓶有两种常用规格：大的约45cm2，小的约30cm2，故所用trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。trizol试剂的加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶底为度，而不是依据细胞的数量，否则可导致dna的污染）具体方法如下：（样品一定要新鲜）
（1）组织接入预冷的ep管中，加入trizol试剂1ml/10cm2（量一定要加足，否则易污染），混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物*分离。
（2） 加lv 仿0.2ml（每1ml trizol试剂加入lv 仿0.2ml），盖好，剧烈震荡15s，置室温2-3分钟。
（3） 4℃离心，10000g×15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-lv 仿相、上层为无色的水相。rna包含在水相中，水相的体积约相当于所加的trizol试剂量的60%。
（4） 仔细吸取上层水相，移至另一ep管中。
（5） 加0.5ml异丙醇，以沉淀rna（每1ml trizol试剂加入0.5ml异丙醇），置室温10min。
（6） 4℃离心，10000g×10min。rna沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。
（7） 弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml（每1ml trizol试剂加入75%乙醇至少1ml），震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，5500g×5min。弃上清液，空气干燥（或真空干燥）后，沉淀重悬于无 rnase dh2o中，吹吸几次，55℃-60℃作用10分钟以溶解rna，-70℃保存备用。
（8）抽提出的细胞总rna干燥后加水50ul，取10ul加无rnase水990ul，稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以无rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：a260/280 ratio<1.6。
（9） 分离组织10mg（纯组织）加800ul trizol试剂。
（10） 扩增产物的鉴定
depc处理方法如下：
1. depc处理
（1）depc水：100ml超纯水加入0.2ml depc，充分混匀，高压灭菌。
（2）tip头(枪头）、ep管等在提rna过程中及做rt时接触rna的器材（包括1ml、200μl、20μl tip头；ep管和pcr反应管等）：用0.1%的depc水（1000 ml超纯水加入1ml depc）37℃浸泡过夜，高压灭菌。
2. 提取rna，用depc水溶解
3. rt
我是用pcr仪来控制温度和时间的，所以rt是在pcr反应管中作的。
4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。
zui 好把要直接接触样品的东西都用depc水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1轕c水，在灭菌就行了；现在有进口的rnase free的枪头买，直接用不用处理的
如何消除污染
机器运行完后，取出pcr产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。
（1）试剂：mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。
（2）加样：原则是dnazui后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是dna不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。
另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，zui容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。
目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了ung来防污染。uracil-dna n-glycosylase（ung）*dna糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。
rna定量
rna也zui 好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。
rna的贮藏，zui主要的是温度，－20不够，zui 好－80，液氮zui保险
mrna是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和rna降解速度的影响
rt-pcr有两种做法：
条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再pcr。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于pcr的进行
一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的
电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，半定量和定量rt-pcr做的都是基因相对表达量，不是jue 对表达量
mrna的分离与纯化中
步骤（4）中将rna溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏rna的二级结构，尤其是mrna poly(a )尾处的二级结构，使poly(a )尾充分暴露，从而提高poly(a )rna的回收率；另一个目的是能解离mrna与rrna的结合，否则会导致rrna的污染。所以此步骤不能省略。
下面，我们介绍一个可以确认rna溶液中有没有残留的rna酶的方法。
3）保温试验
方法很简单的，按照样品浓度，从rna溶液中吸取两份1000 ng的rna加入至0.5 ml的离心管中,并且用ph7.0的tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明rna溶液中没有残留的rna酶污染，rna的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明rna溶液中有rna酶污染。
pcr污染与对策
pcr扩增产物污染，这是pcr反应中zui主要zui常见的污染问题，所以，扩增区的仪器什么如枪头等要注意。
还有一种容易忽视，zui可能造成pcr产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备；
2. pcr扩增区，包括反应液的配制和pcr扩增；
3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离，操作器材，要有一定的方向性。如：标本制备→pcr扩增→产物分析→产物处理。
切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
使用一次性吸头，严禁与pcr产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；
操作多份样品时，制备反应混合液，先将dntp、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的度。
反应液污染
可采用下列方法之一处理：
1. dnase i法：pcr混合液（未加模板和taq聚合酶）加入0.5u dnase i，室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和taq聚合酶进行正常pcr扩增。该方法的优点是不需要知道污染dna的序列；
（三）*糖苷酶（ung）法
由于uv照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的pcr扩增片段通常为300bp左右，因此ung的预防作用日益受到重视和肯定。
1、提取mrna时所用的ep管、玻璃等器皿全部都要用0.1轕c水浸泡。然后烘干，高压灭菌，再烘干。
2、用depc水洗过后当然不能用双蒸水洗了。那你用depc处理还有什么意义呢？还要用双蒸水洗吗？
3、玻璃器皿干烤：180度，8小时或更长时间；小器皿也可以用少许lv 仿处理一下。另外，铁制品、研砵等也可倒上酒精直接烧。