压缩是正畸牙齿移动（otm）期间正畸压缩力（cf）诱导的特定微环境的标志之一，因为它能够影响成牙骨质细胞稳态。在otm期间，压缩力会触发牙周膜（pdl）的炎症性破骨细胞生成和重塑过程，以进一步产生免疫抑制性缺氧微环境，从而损害otm的过程。由于正畸诱导的炎症性牙根吸收（oiirr）是正畸牙齿移动的一种严重副作用，因此压缩力对牙骨质生理学的作用越来越受到关注。成牙骨质细胞是调节牙骨质稳态以及通过参与先天免疫防御来预防oiirr的负责细胞群。因此，这些细胞在基础正畸研究中得到了深入研究，特别是关于它们对正畸压缩力或牙周病原体及其成分（如肽聚糖）的反应。
牙龈卟啉单胞菌（p. gingivalis）是一种革兰阴性厌氧菌，被认为是慢性牙周炎进展的关键病原体之一。牙龈卟啉单胞菌细胞壁的一个组成部分是肽聚糖（pgn）。牙龈卟啉单胞菌pgn是一种普遍存在的细菌成分，尽管它具有强大的促炎特性，但也可能在免疫防御反应中发挥作用。已知它可以刺激人牙龈角质形成细胞中丰富的pd-l1蛋白表达，但这尚未在成牙骨质细胞中得到证实。重要的是，牙周致病菌之一的牙龈卟啉单胞菌与正畸力（cf）相互作用的分子和细胞机制在成牙骨质细胞中尚不了解。
缺氧诱导的pd-l1表达已在多种原发性和各种癌细胞类型中发现。缺氧诱导转录因子（hif）是正畸力转录反应的关键调节因子，据报道可调节成牙骨质细胞的凋亡过程。然而，目前尚不清楚hif-1α是否调节成牙骨质细胞中 pd-l1 的表达。去年，德国尤斯图斯·李比希吉森大学医学院口腔正畸学系、牙周病学系的一项研究观察结果强调了理解pd-l1表达在成牙骨质细胞中如何调节的机制的重要性。
牙龈卟啉单胞菌 pgn 触发成牙骨质细胞中 pd-l1 的上调
首先，实验采用所有方法验证了不同浓度的牙龈卟啉单胞菌pgn感染后pd-l1在成牙骨质细胞中表达的动力学。结果发现，用牙龈卟啉单胞菌pgn刺激成牙骨质细胞导致pd-l1蛋白表达以浓度依赖性方式上调，在100 μg/ml时达到峰值。pd-l1的if染色结果显示，牙龈卟啉单胞菌pgn（100 μg/ml）感染细胞中pd-l1的表达明显高于未受刺激细胞。rt-qpcr基因表达分析显示，100 μg/ml牙龈卟啉单胞菌pgn 刺激24 h后，pd-l1 mrna水平明显高于孵育开始时间点（0）。
这些数据表明，牙龈卟啉单胞菌pgn以剂量和时间依赖性方式显著上调了成牙骨质细胞中的pd-l1分子表达，从4小时开始，在8小时后达到峰值，然后在12小时后衰减至48小时。
压缩力触发 occm-30 细胞中 pd-l1 和 hif-1α 的表达
由于压缩是正畸诱导微环境的主要组成部分之一，因此，首先在永生化小鼠成牙骨质细胞系occm-30上研究cf对免疫检查点之一的程序性死亡受体配体1（pd-l1）表达的影响。结果表明，载荷量为 2.4 gf/cm2 的cf在8、12和24小时内显著增加了pd-l1 在mrna和蛋白质水平上的表达（图1 b、c）。同样，通过pd-l1的免疫荧光染色可见，cf组表达强烈上调（图1 d）。
进一步研究了cf是否可以诱导occm-30细胞中的hif-1α表达。结果表明，cf显著增加了成牙骨质细胞中hif-1α蛋白和基因的表达。还观察到hif-1α在压缩细胞中含量丰富。
因此，这些结果表明，压缩力导致成牙骨质细胞中pd-l1轻微上调，促进了hif-1α的表达。
图1 响应压缩力的occm-30细胞中pd-l1和hif-1α的上调。
用正畸力（2.4 gf/cm2）压缩成牙骨质细胞培养物，在不同时间段（1，2，4，6，8，12和24小时）。（a）生理细胞培养条件和受压缩力（cf）刺激的细胞的照片。（b、c）通过免疫印迹法测定pd-l1蛋白表达，并通过if染色检测其定位。（d）在特定时间点压缩力下培养的occm-30细胞中pd-l1基因表达的rt-qpcr定量。（e、f）通过蛋白质印迹法测定hif-1α蛋白表达。采用if法评估hif-1α定位。（g）在特定时间压缩力下培养的occm-30细胞中hif-1α基因表达的rt-qpcr定量。
压缩介导牙龈卟啉单胞菌pgn触发的pd-l1在成牙骨质细胞上的表达
wb分析显示，pd-l1在牙龈卟啉单胞菌pgn感染的成牙骨质细胞中表达上调（图2 a-d）。重要的是，特别是在与cf和牙龈卟啉单胞菌pgn共刺激24小时后，pd-l1蛋白表达增强。与对照组（7.19±0.60%）相比，牙龈卟啉单胞菌 pgn或cf也增加了坏死性凋亡的比例（分别为11.22±0.75%；14.79±1.84%）（图2 e、f）。牙龈卟啉单胞菌pgn联合cf显著增加成牙骨质细胞坏死性凋亡（39.55±4.51%）（图2 e、f）。这些结果表明，压缩力可以调节牙龈卟啉单胞菌pgn诱导的pd-l1表达并参与成牙骨质细胞的坏死性凋亡。
图2 压缩力以及牙龈卟啉单胞菌pgn触发pd-l1表达并参与坏死性凋亡调节。在存在或不存在压缩力（2.4 gf/cm2）的情况下，用确定浓度的牙龈卟啉单胞菌pgn（100 μg/ ml）处理成牙骨质细胞。（a-d）在存在或不存在cf的情况下，pd-l1在牙龈卟啉单胞菌pgn处理的细胞上表达水平的蛋白质印迹分析。（e、f）通过流式细胞术分析显示了膜联蛋白-v fitc和pi染色的代表性图。坏死性凋亡率（annexin-v fitc+/pi+）显示在右上象限。图形显示了在存在或不存在压缩力的情况下，暴露于牙龈卟啉单胞菌pgn的坏死性凋亡细胞的百分比。
压缩作用下牙龈卟啉单胞菌pgn诱导的pd-l1和hif-1α在成牙骨质细胞中的相关性
为了探讨牙龈卟啉单胞菌pgn诱导的pd-l1表达是否依赖于hif-1α，使用了hif-1α抑制剂idf11774。wb结果表明，hif-1α在压缩作用下的阻断显著消除了牙龈卟啉单胞菌pgn诱导的pd-l1蛋白上调（图3 a、b）。if染色显示，在牙龈卟啉单胞菌pgn刺激下，抑制 hif-1α对诱导性pd-l1表达具有显著抑制作用（图3 c）。此外，在与idf11774共刺激24小时后，观察到细胞坏死性凋亡（图3 c、d）。在存在压缩力的情况下，idf11774增加了坏死性凋亡细胞的百分比。牙龈卟啉单胞菌pgn加cf组坏死性凋亡细胞的百分比也有所增加（图3 e）。因此，这些证据表明，hif-1α是压缩力下牙龈卟啉单胞菌pgn诱导的pd-l1 mrna和蛋白质表达的主要调节因子。
图3 牙龈卟啉单胞菌pgn诱导的pd-l1表达取决于occm-30细胞在压缩力下的hif-1α信号。将occm-30细胞与不同浓度的hif-1α抑制剂idf11774预孵育2 h，然后分别用牙龈卟啉单胞菌pgn结合压缩力刺激24 h。
（a、b）响应idf11774（20 um）的pd-l1蛋白水平的蛋白质印迹分析。（c）代表性if染色显示24小时后pd-l1在存在或不存在idf11774的情况下在牙龈卟啉单胞菌pgn刺激的occm-30细胞中表达。（d、e）计算暴露于hif抑制剂的坏死性凋亡细胞的百分比以及与牙龈卟啉单胞菌pgn和cf共同刺激的坏死性凋亡细胞的百分比。（f）occm-30细胞可以在体外释放可溶性gas-6，如果hif-1α被抑制剂阻断，这种作用就会受损。此外，牙龈卟啉单胞菌pgn诱导的gas-6释放被hif-1α阻断剂拮抗。
hif-1α 通过减少 gas-6 分泌参与成牙骨质细胞的免疫调节
据描述，可溶性gas-6在pdl细胞的稳态中发挥免疫调节作用。因此，实验旨在分析occm-30细胞是否可以释放gas-6，并且在存在或不存在hif-1α抑制剂的情况下，通过与牙龈卟啉单胞菌pgn和/或cf的共同刺激是否可以改变其表达。结果表明，occm-30细胞具有释放gas-6（27.67 ±11.15 pg/ml）的特性，并且该释放对idf11774（18.04 ± 8.43 pg/ml）的使用无显著影响（图3 f）。用牙龈卟啉单胞菌pgn处理不会改变gas-6的产生。有趣的是，在cf和cf加牙龈卟啉单胞菌pgn刺激条件下，idf11774导致gas-6的释放分别降低至10.72±1.82 pg/ml和19.33±8.84 pg/ml。因此，这些结果表明，gas-6是成牙骨质细胞的免疫调节剂，可以通过hif-1α被释放和调节。
图4 该方案描述了hif-1α在成牙骨质细胞中的作用方式：牙龈卟啉单胞菌pgn刺激了成牙骨质细胞的pd-l1上调。压缩力诱导occm-30细胞表达hif-1α和pd-l1。牙龈卟啉单胞菌pgn和压缩力的共刺激调节pd-l1表达，增加occm-30细胞坏死凋亡比。抑制hif-1α可抑制pd-l1表达以及可溶性gas-6的产生。因此，hif-1α在压缩力作用下调节成牙骨质细胞中pgn-诱导的pd-l1表达中起重要作用。
基于体外小鼠成牙骨质细胞模型，该研究表明，牙龈卟啉单胞菌pgn上调了成牙骨质细胞的pd-l1，并且这种效果通过hif-1α响应压缩力而维持。激活hif-1α调节成牙骨质细胞的坏死性凋亡。阻断hif-1α可通过减少gas-6释放来消除成牙骨质细胞的免疫反应。
该数据表明，在正畸诱导的微环境下，免疫检查点pd-l1与hif-1α在成牙骨质细胞免疫抑制中相关。此外，通过使用hif-1α和pd-l1靶向抑制，在otm期间对牙周炎个体进行oiirr的免疫治疗可能有助于免疫反应。
参考文献：yong j, gröger s, meyle j, ruf s. immunorthodontics: role of hif-1α in the regulation of (peptidoglycan-induced) pd-l1 expression in cementoblasts under compressive force. int j mol sci. 2022 jun 23;23(13):6977. doi: 10.3390/ijms23136977. pmid: 35805974; pmcid: pmc9266671.