摘要：本文介绍了采用配置 apci 源的 agilent 6470 三重四极杆液质联用系统，同时检测沙坦 药物中六种亚硝胺类基因毒性杂质 ndma、ndea、nmba、neipa、ndipa 和 ndba 的 方法。该方法涵盖了欧美药检系统截止到 2019 年 11 月提到的全部亚硝胺类基因毒性杂 质，操作简单、特异性高，且灵敏度满足目前*，适用于沙坦类原料药和部分制剂 中 6 种亚硝胺类基因毒性杂质的快速筛查和准确定量。
前言：2018 年 7 月，*原料药被曝出含有亚硝胺类基因毒性杂质 n-亚硝基二jia胺 (ndma)， 9 月份，该类药物又曝出含有另一种亚硝胺类杂质 n-亚硝基二乙胺 (ndea)。2019 年 3 月，第三种亚硝胺类杂质 n-亚硝基-n-甲基-4-氨基丁酸 (nmba) 在*中检出超标[1]。 沙坦类降压药的全名是“血管紧张素受体阻断剂”(arb)。由于此类药物都带有“沙坦” 二字，因此俗称“沙坦类降压药”，是目前治疗高血压的一线降压药，使用广泛。亚硝胺 (nitrosamine) 是一类通式为 r1 n(–r2 )–n=o 的胺化合物，结构如图 1 所示，其大部分成 员都属于强致癌物。根据世界卫生组织癌症研究机构公布的致癌物清单，从沙坦类降 压药中发现的 ndea、ndma 属于 2a 类致癌物，即“对人很可能致癌，此类致癌物对人 致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分”[2]。另外，根据 fda 的初步评估，nmba 暴露风险与 ndma 相同[1]。
目前，关于沙坦类药物中亚硝胺的检测，可以在上查到欧洲 omcl 实验室和 fda 公布的 gc/ms、lc 和 lc/ms 方法。其中， fda 在 2019 年 8 月公布了 lc-hrms 方法和 rapidfire-ms/ms 方法[3, 4]，对沙坦类药物中可能含有的 6 种亚硝胺类基因毒性杂 质进行筛查和半定量分析。fda 提出，除先前检出的 ndea、 ndma 和 nmba 以外，根据文献报道和工艺研究，还有三种亚 硝胺类杂质可能存在于 arb 药物中，分别是 n-亚硝基乙基异丙 基胺 (n-nitrosoethylisopropylamine, neipa)、n-亚硝基二异丙 基胺 (n-nitrosodiisopropylamine, ndipa) 和 n-亚硝基二丁基胺 (n-nitrosodibutylamine, ndba)。鉴于 lc-hrms 和 rapidfire-ms/ms 配置比较特殊，且无法用于准确定量分析，我们参考 fda 方法， 开发出采用常规 lc-apci-qqq 配置同时检测沙坦药物中 6 种亚硝 胺类基因毒性杂质的方法。所开发的方法操作简单、特异性高， 且灵敏度满足目前*。
实验部分：试剂和样品 甲醇为质谱级，甲酸为色谱级，购于 merck；所用实验用水为 millipore milli-q 超纯水系统现制备的高纯去离子水；6 种亚硝胺 标准品和样品由合作用户提供。
仪器和设备：采用 agilent 1290 infinity ii 超高效液相色谱系统与 6470三重四 极杆液质联用系统。液相色谱系统配备如下：二元泵（部件号 g7120a）、自动进样器（部件号 g7167b）、柱温箱（部色谱柱选用 agilent infinitylab poroshell pfp（2.1 × 100 mm, 2.7 μm，部件号 695775-408）。如果沙坦类样品色谱保留较强 （如*和*），也可以用 agilent infinitylab poroshell 120 ec-c18（2.1 × 100 mm, 2.7 μm，部件号 695775-902）进行 分离。件号 g7116b）。
标准溶液制备 精确称取 6 种亚硝胺标准品，加甲醇超声溶解，并定量稀释制成 每 1 ml 中约含 10 mg 目标化合物的高浓度标准品溶液。用水逐 级稀释成每 1 ml 中分别包含约 0.1、0.5、1、5、10、50、100、 500、1000 ng 目标化合物的溶液，作为标准品线性系列溶液。线 性范围和相关浓度点可根据检测需要自行调整。
样品前处理：将 100 mg 沙坦类样品研磨后，溶于 10 ml 水中，用超声提取 10 分钟，过滤后分析。 对于水溶性欠佳的沙坦样品，先用大约 2 ml 甲醇溶解后，经超声 提取后，用水稀释到 10 ml，再次超声提取 10 分钟，滤除沉淀后 进行分析。终浓度以 api 计为 10 mg/ml。
结果与讨论：色谱分离结果 本文参考 fda 方法，基于窄内径 poroshell 系列色谱柱低柱压、 高柱效的优势，适当降低了流速，缩短了梯度时间和平衡时间。 不同沙坦类药物在反相色谱体系中保留能力不同。因此，本文分 别对*和*进行了测试，两者在常规 c18 色谱柱上可 以分离。而*保留相对较弱，需要采用 pfp 色谱柱以改善 api 的保留特性，确保分子量较大的 ndba 获得理想的回收率。 洗脱梯度起始采用高比例水相，需要注意复溶样品的有机相不宜 过高，否则会影响分子量较小的 ndma 的峰形和灵敏度。梯度后 半段采用高比例有机相洗脱沙坦类 api。由于 api 浓度很高，为 避免污染质谱系统，建议此时将流路设置为“引入废液”。 在本文中所用的色谱条件下，6 种亚硝胺之间及杂质与 api 之间 分离度良好，典型的 tic 色谱图如图 2 所示。因为受限制的 n-n 键存在顺反结构 (syn and anti conformers)[5]，nmba 和 neipa 在 色谱体系中表现为双峰，在定量分析时，需要对两个峰积分并合 并峰面积[1]。 ×104 +ttc mrm (** -> **
结论： 根据 fda 的报告，沙坦类药物中含有或可能含有 6 种亚硝胺类 基因毒性杂质，即 ndma、ndea、nmba、neipa、ndipa 和 ndba。本文采用配备 apci 源的 6470 三重四极杆液质联用系 统，同时检测上述 6 种亚硝胺类化合物，方法简单、特异性高、 重现性好，灵敏度满足目前 fda 规定的*。实验中测试了 不同的沙坦基质，采用适合的色谱柱和色谱方法，可以很好地满 足灵敏度和回收率要求。另外，通过将方法设置为将高浓度药品 基质引入废液而不引入离子源，可减少对质谱系统的污染。该方 法适用于对沙坦类原料药和部分制剂中的 6 种亚硝胺类基因毒性 杂质进行快速筛查和准确的定量分析。