一、蛋白表达载体构建
1.1. 蛋白表达载体构建试剂
高保真pcr预混液，琼脂糖凝胶回收试剂盒，同源重组克隆试剂盒，dh5α感受态细胞，高纯度质粒小提试剂盒。
1.2. 蛋白表达载体构建方法
1.2.1. 根据基因cds序列，设计上游和下游引物并进行引物合成。
1.2.2. 使用高纯度质粒小提试剂盒提取含有cds序列的质粒模板，或者使用客户提供的质粒模板，对目的cds进行pcr扩增。
1.2.3. pcr反应程序
1.2.4. pcr产物回收
pcr结束后，进行琼脂糖凝胶电泳。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒，对目的条带进行胶回收。pcr产物回收后，测定回收产物的浓度，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5. pcr产物与蛋白表达载体的连接转化与鉴定
使用同源重组方法，将目的片段与蛋白表达载体进行连接。将连接产物转化到dh5α感受态细胞中，涂布于含有抗生素的lb培养基上，倒置培养。挑取单菌落进行菌落pcr鉴定，对扩增出目的条带的菌落进行质粒提取与测序。将测序结果与cds进行序列比对。
1.2.6. 蛋白表达载体的质粒提取
对构建正确的蛋白表达载体，进行质粒的提取，为后续蛋白表达做准备。
二、基因组dna的提取
2.1. 基因组dna提取试剂
根据不同物种、组织和器官，使用相应的提取试剂或者试剂盒。例如：ctab提取试剂盒、植物通用型提取试剂盒、磁珠法提取试剂盒、含多糖多酚样本的基因组dna提取试剂盒。
2.2. 基因组dna提取方法
2.2.1. 称取适量样本材料，液氮速冻，研磨成粉末，使用相应的试剂盒进行基因组dna提取。
2.2.2. 对提取的基因组dna的质量进行检测，包括基因组dna浓度，纯度，电泳。
三、亲和纯化文库构建
3.1. 亲和纯化文库构建试剂
3.1.1. dna建库试剂盒（bioo scientific，nova-5188-01-nextflex-rapid-dna-seq-kit-2.0）。
3.1.2. dna clean beads （mich scientific，货号ngs-0201-100）
3.2. 亲和纯化文库构建方法
3.2.1. 取适量基因组dna进行片段化。
3.2.2. 对片段化后的基因组dna进行筛选。
3.2.3. 取适量片段筛选后的基因组dna进行亲和纯化文库的构建，具体方法详见nova-5188-01-nextflex-rapid-dna-seq-kit-2.0建库试剂盒说明书（bioo scientific）。
3.2.4. 文库构建结束后进行质检。
四、体外无细胞蛋白表达与检测
4.1. 体外无细胞蛋白表达的主要试剂
4.1.1. 无细胞蛋白表达试剂盒
4.1.2. 用于进行western blot检测的一抗和二抗。
4.2. 体外无细胞蛋白表达反应方法
根据无细胞蛋白表达试剂盒的使用说明，建立以下反应体系，然后25 °c孵育2 h。
4.3. 体外蛋白表达检测
4.3.1. 体外蛋白表达结束后，取适量反应液，进行sds page和western blot，检测有无目标蛋白的特异性条带。
五、蛋白质与文库的亲和纯化
5.1. 亲和纯化所需要的主要试剂和设备
5.1.1. 亲和纯化磁珠
5.1.2. 平衡缓冲液
5.1.3. 24孔磁力架（michscientific，货号magpow-24）
5.2. 亲和纯化方法
5.2.1. 将平衡好的磁珠与平衡缓冲液混匀。
5.2.2. 将蛋白表达预混液与磁珠充分混匀后进行孵育。
5.2.3. 向上述混合液中加入适量文库后充分混匀后进行孵育。
5.2.4. 洗涤非特异性结合dna，洗脱特异性结合的dna。
六、洗脱文库扩增质检与测序