遗传中心法则表明,dna是生物体内遗传信息的载体。遗传信息在精密的调控下从dna转录成rna,再传递到蛋白质。因此rna被认为是dna与蛋白质之间生物信息传递的“桥梁”,在研究转录组信息中占有着重大的作用。
背景介绍
转录组(transcriptome)是指在某一特定的生li条件下,细胞、组织或者生物体内所有的转录产物的集合,即转录出来的所有rna总和,包括编码rna(即mrna)和ncrna(trna、rrna、mirna、lncrna、circrna)等不同类型的rna分子。在这之中核糖体rna (rrna) 约占rna总量的 80%,是zui多的一类rna,通常这类rna分子量比较大且代谢不活跃,种类包括:原核生物中5s rrnas、16s rrnas和23s rrnas三种,真核生物中5s rrnas、5.8s rrnas、18s rrnas和28s rrnas四种。
图1:rna分类图
rrna的“作用”
随着人类基因组计划(hgp)和dna元件百科全书计划(encode)的完成,人们发现在人类基因组中大部分dna都可以转录成rna,但是仅有1.5%的核苷酸序列用于蛋白质的编码,剩余不编码蛋白质的的非编码rna(ncrna),被认为是基因组转录噪音。这种转录组噪音(无效信息)基本全部来源于丰度zui高的成员——rrna。
测序的目的就是为了更多的获得生物信息,但是rrna这个在rna中zui丰富的成员却只能提供非常少的转录本的信息,且检测到过多的rrna会掩盖其它基因的表达丰富度;因此,通常在测序之前从rna样品中除去rrna,rrna去除的效率也被视为zui大化读取到转录物的关键因素。
图2:人类组织或细胞总rna中各种rna分布饼状图
rrna的“去除法”
目前rrna去除的方法主要有两种,一种是通过dna探针或者rna探针杂交捕获rrna再用磁珠吸附去除的方法,这种方法称为ribo-zero-seq;另一种是利用双链特异性核酸酶处理的方法提取mrna,称为dsn-seq。两种方法对应的原理与区分如下所示:
方法一(dsn-seq)
去除流程:特异性探针(区分物种)与rrnas杂交——rnase h消化rrnas——dnase i消化探针——其他rna富集纯化
市场占比:在市场现有品牌中占据绝大多数
优势:样本起始量要求低;rrna残留量更低
缺点:其操作较复杂;暂无混合样本效果验证;
流程图:
方法二(ribo-zero-seq)
去除流程:生物素标记探针与rrnas杂交——链霉亲和素磁珠去除探针与rrnas——其他rna富集纯化
市场占比:illumina ribozero与thermo ribominus系列使用该方法
优势:磁珠法,操作简单;可应用于混合样本;
缺点:样本起始量要求高(一般为1 μg);rrna残留量相对方法1略高;
流程图:
rrna的“高效去除”
hieff ngs® maxup rrna depletion kit (human/mouse/rat)利用rnase h消化法去除人、小鼠、大鼠总rna中的核糖体rna。该试剂盒对于完整和部分降解的总rna(如ffpe rna)均具有良好的rrna去除效果。可用于高通量测序分析mrna和非编码rna,也可用于cdna合成或其它下游应用。
图3:1μg 293t 总rna 进行 rrna 去除,利用 qpcr 对比去除前后 rrna 基因和 mrna 基因的ct值变化(左图)
分别以1μg 人、小鼠、大鼠总rna为样本,试剂盒去除rrna后建库,测序获得rrna残留%数据(右图)