（1）引物及浓度：①长度：15～30bp。②碱基：g+c含量以40%～60%为宜，atgc最好随机分布，避免5个以上的碱基成串排列。③避免引物内部出现二级结构、两条引物间互补，特别是3′端的互补。④引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对。⑤与其它序列无明显同源性。⑥浓度为0.1～1μmol或10～100pmol。（2）酶及其浓度：催化一典型的pcr反应约需酶量2.5u（指总反应体积为100μl时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。（3）dntp的质量与浓度：dntp应为50～200μmol/l，4种dntp的浓度要相等（等摩尔配制），过高dntp能与mg2+结合，使游离的mg2+浓度降低。（4）模板：模板的量与纯化程度，是pcr成败与否的关键环节之一，避免dna纯化中的sds和蛋白酶k等杂质。（5）mg2+浓度：一般的pcr反应中，各种dntp浓度为200μmol/l时，mg2+浓度为1.5～2.0mmol/l为宜。mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低taq dna聚合酶的活性，使反应产物减少。（6）温度与时间：①变性：93℃～94lmin℃，过高或过低的温度影响酶的活性。②退火：取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。一般高于tm值5℃～10℃，时间为30～60s。③延伸：常用温度为72℃，时间根据待扩增片段的长度而定。（7）循环次数：主要取决于模板dna的浓度。一般的循环次数选在30～40次，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。