02/下篇
knock-in
对于knock-in，目前还存在一定的难度，大多数的出版物只能实现10-40%的敲入效率，不同位点也存在差异。nature biotechnology今年5月的一篇出版物利用sleek (selection by essential-gene exon knock-in)技术可以在t细胞上实现超过90%的ki效率，同样在其他常用的免疫细胞如nk，b cell，ipsc等细胞都实现了非常高的ki效率。
对于常规的ki实验，我们依然可以从以下方面考量进行进一步优化：
donor dna用量的测试
▲theodore l roth et al., 2018
▲zelda odé et al., 2020
ha长度
ha的长度会影响ki的效率，但并不意味着越长越好。
▲zelda odé et al., 2020
▲soyoung a. oh et al., 2022
ha修饰
▲brian r. shy et al., 2021
▲jonas kath et al., 2022
特殊成分提高hdr效率的测试
也有文献结果表明pga对ki的效率没有帮助，仅供参考。
▲ya-wen fu et al., 2021
▲david n. nguyen et al., 2020
选择dsdna或ssdna或aav载体进行ki
dsdna会随着用量的增加显著增加对细胞活率的影响。
▲theodore l roth et al., 2018
hdr enhancer
▲jonas kath et al., 2022
甚至hdr, rnp, 细胞的混匀顺序也可能会对结果造成影响
▲theodore l roth et al., 2018
电转前后培养体系
▲theodore l roth et al., 2018
nucleofection 条件优化
通常可以参考ko的条件进行ki实验，但依然可以依照具体的实验需求调整。
▲theodore l roth et al., 2018
▲soyoung a. oh et al., 2022
对于knock-in，还可以通过其他手段提升结果，如pam and track mutations, 具体内容可以参考如cas蛋白或sgrna供应商。
通常ko不会对细胞的活率产生太大影响，但是对于ki，需要用到donor dna，如dsdna，或者使用更强的电转染条件，这些可能会导致活率的负面影响。