腈水解酶的结构与作用机制及应用领域！
一、背景及概述
腈化合物是一类含腈基功能团的化学物质(r-cn)，是一种重要的合成原料。它们种类繁多，常见的如氰酸、乙腈、丙烯腈、苯甲腈、3-腈基吡啶、3-吲哚乙腈、氰酸等。由腈化合物出发可以获得酰胺、酸、酯等价值更高、应用范围更广的一类化合物，它们被广泛的应用于化工原料、医药中间体、维生素的前体。腈水解酶是由thiman和mahadevan在1964年的时候从大麦叶中分离出来，能够将吲哚乙腈水解成为吲哚乙酸，故将其命名为吲哚乙腈水解酶。但是在后来的研究中发现，该纯酶对26种不同的腈化合物均具有活性，它水解3-氰基吡啶的活力是吲哚乙腈的8倍。因此thiman和mahadevan将其命名为腈水解酶。
二、结构及其酶作用机制
最初认为腈水解酶是用来水解芳香族腈化合物和不饱和脂肪族腈化物，而饱和脂肪族腈化物则是由腈水合酶与酰胺酶共同作用降解的。也有报道说腈水解酶分为三类：脂肪腈水解酶、芳香腈或杂环腈水解酶和乙酰腈水解酶。但从近年的研究看来这种看法未免简单化，实际上腈化物的反应途径取决于底物的立体因素及电子因素。所以在不同底物的诱导下，同一来源的腈水解酶有不同的活性。
从上表也可以看出不同来源的腈水解酶的亚基分子量和天然构象也不尽相同，许多腈水解酶包含相同的多肽，分子量为40kd左右(32～45kd)。不同的酶又是有不同数量的亚基聚合而成，一般的亚基数为2～26。f.oxysporum中的腈水解酶在page凝胶出现多条带，分子量范围为170～880kd，相隔的两条带之间相差70kd(2×34kd)。每条带都具有催化能力，这也表明由4～26个亚基组成的酶都具有活性，而且亚基一般都是成对出现。
r.rhodochrouspa-34中的腈水解酶以分子量为45kd的单个亚基的形式存在。能降解溴苯腈的k.pneumoniaessp.ozaenae产生的水解酶以二聚体的形式存在。另外在不同的培养条件下，菌体产生的水解酶也有所差异。筛选到的nocardiancib11216分别在苯甲腈是否存在的条件下培养，当没有苯甲腈存在的情况下，纯化得到的酶经凝胶过滤测得分子量为47kd；而在苯甲腈存在的情况下，纯化得到的酶分子量为560kd。另外，亚基的聚合和ph值、温度以及酶的浓度有关，该酶的聚合ph值为7.3，当温度低于20℃时，聚合速度十分缓慢。
三、应用
1、在医药中间体合成中的应用
近几年来腈水解酶的生物催化技术正突飞猛进的发展，尤其是在医药中间体生产中的应用已经取得了瞩目的成就，相关文献发表和申报呈现稳健增长之势。总体来看，最近几年腈水解酶在医药中间体合成中的应用主要集中于吡啶甲酸、扁桃酸及其衍生物、单腈单酸以及药用氨基酸等这几大类化合物。
1）吡啶甲酸
吡啶甲酸包括烟酸、异烟酸和2-吡啶甲酸这三种同分异构体。烟酸也称维生素pp或3，是人体必需的13种维生素之一，作为药物中间体可合成多种用于治疗皮肤性疾病、高血压症和冠心病等的药物，也可用于制备尼可刹米及烟酸肌醇酯；异烟酸是合成抗结核药物的中间体，其衍生物异烟酰肼和异烟酰腙即用作抗结核药物；2-吡啶甲酸在医药生产中用于制备卡波卡因药物，还可降低糖尿病人的血糖水平和胰岛素抗药性，而且能预防心脑血管病。
2）扁桃酸及其衍生物
扁桃酸在医药领域具有重要的应用，可用于合成头孢菌素、血管紧张肽转化酶抑制剂、抗肥胖药物及抗肿瘤药物等，也可用作防腐剂。由于单一构型的扁桃酸与外消旋扁桃酸相比药效更高、副作用更低，具有广阔的市场前景，采用高立体选择性的腈水解酶拆分外消旋的扁桃腈合成单一对映体扁桃酸受到了广泛关注。
以正丁腈为诱导剂培养的粪产碱菌(a．faecalis)atcc8750腈水解酶对扁桃腈具有较高特异性，用游离细胞催化剂选择性催化外消旋扁桃腈可生成相应(ｒ)扁桃酸，产物收率为91%，ee值可达。将恶臭假单胞菌(p．putida)mtcc5110腈水解酶基因在大肠杆菌中进行了重组表达，并对产酶条件进行了系统优化，重组酶对扁桃腈表现出较高的腈水解酶活力，最终转化结果表明(ｒ)-扁桃酸的收率及ee值分别达到87%和99.99%。
3）单腈单酸
单腈单酸作为药物中间体十分常见，采用二腈类化合物进行选择性水解即可制备。然而常规的化学水解很难一步实现该反应，并且产率难以提升，而采用酶法则有望解决该问题。扩增获得一株敏捷食酸菌(acidovoraxfacilis)72w的腈水解酶编码基因，并在大肠杆菌中进行了过量表达，重组酶对脂肪族二腈具有较强的立体选择性，能将2-甲基戊二腈转化为4-氰基戊酸，底物转化率达到，产物中无酰胺化合物生成，2-甲基戊二酸是的副产物且含量低于2%；进一步使用固定化细胞进行连续批次转化，催化剂可重复利用195个批次，催化剂产率为3500g4-氰基戊酸/g干细胞，并且最终催化剂仍能保留67%的腈水解酶活性。
4）药用氨基酸
氨基酸在医药上的关键作用正日益受到人们重视，应用范围也越来越广泛。采用腈水解酶介导的生物催化合成途径是药用氨基酸生产工业中的一条重要途径。作为药用氨基酸中间体原料，除天然氨基酸外，越来越多的非天然氨基酸也逐步开发出来。d-苯甘氨酸是合成多种抗生素的中间体，如氨苄青霉素和头孢氨苄等。文献报道鞘氨醇单胞菌(s．wittichii)ｒw1重组腈水解酶能特异性水解苯胺基乙腈合成d-苯甘氨酸，采用水-1-辛醇的两相体系进行转化，在25℃，100mm底物的情况下，通过48h转化，产物收率为81%，ee值也保持在95%以上。
2、腈水解酶在腈纶及涤纶改性中的应用
近年来，随着“绿色生产”呼声的提高，生物酶在纺织染整工业上的应用日渐得到人们的关注。腈水解酶作为一种生物催化剂，具有高度的专一性，高效性(比一般催化剂高106～1013倍)，催化反应条件温和、可降低能耗、节省能源、催化活性可调节控制等特点，用于纺织品的湿加工具有的优点。腈水解酶用于纺织品整理，能从一定程度上改善织物的外观与手感。同时酶是蛋白质，本身无毒，且容易生物降解，用腈水解酶取代染整加工中的部分酸、碱、氧化剂等化工原料，可大大降低污水排放，减轻环境污染，所以生物酶加工作为绿色生产工艺具有极大的发展潜力。而且由于酶多为大分子蛋白质，而腈纶分子结构规整致密，所以酶对腈纶上氰基的催化水解主要停留在纤维表面，不致于影响纤维大分子主链的结构，可以保持腈纶原有的优异的物理机械性能。
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