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小鼠elisa试剂盒检测步骤

小鼠elisa试剂盒检测步骤:
1 制备含mmp底物蛋白的sds-page凝胶:推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备sds page凝胶。将10 × substrate g 融化,并90 ºc 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate g 并使之稀释10倍,混匀后加入过硫酸铵和temed,等待凝胶聚合。
2 待测样品1:1 稀释于2 × sds-page non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% sds, 100 mm tris-cl ph6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上样。切勿加热变性,并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。小鼠elisa试剂盒可通过预试验确定加样量,使用普通蛋白预染marker 即可。阳性对照(可选步骤):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × sds-page nonreducing buffer 等体积混合,取5-15μl 上样。
3 低电流恒流电泳,每一块小胶电流为20 ma/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
4 洗涤凝胶:取出凝胶,去除浓缩胶,放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10 ml 1× buffer a(用蒸馏水稀释),室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。
5 孵育:倒掉buffer a。加入10 ml 1× buffer b(蒸馏水稀释),室温或37ºc 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的mmp 通常37ºc 孵育1 小时即可显示。如mmp 活性低,应延长孵育时间为10小时或过夜。
6 显色:倒掉buffer b,加入sds-page凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(操作步骤见后面所附sds-page凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书)。凝胶的大部分区域被深染,在有mmp 条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示mmp-2、mmp-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (mmp-2)、92 (mmp-9)、130 (prommp-9)、225 (prommp-9) kda位置出现透明条带。
7 条带扫描:将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然mmp条带透明,但凝胶背景并非真正全黑。解决办法:可用非透射光扫描,或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示,并尽量设置为黑色。mmp 条带则为白色,这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。
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