本期主题为“水稻基因组dna的southern杂交与非放射性ecl直接核酸标记及检测”，主要是满足初学者对southern杂交的了解。 southern杂交的新手们不妨参考下。
【实验目的】
通过本实验学习和掌握southern转膜、辣根过氧化物酶直接标记探针、southern杂交及增强化学发光(ecl)检测分子杂交结果的过程。
【实验原理】
southern杂交是一项在复杂的背景基因中识别特异性dna序列的重要技术之一，它是southern于1975年*的杂交方法。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链dna在一定的条件下可按碱基互补原则(a=t,c=g)形成双链。杂交的双方是待测核酸序列及标记的探针。此杂交过程是高度特异性的。
ecl直接核酸标记及检测系统用辣根过氧化物酶(hrp)直接标记探针。该法用带正电荷的核酸标记试剂(经修饰成为带正电荷的hrp聚合体：hrp—对苯醌—聚乙烯亚胺复合物)与变性过的、带负电荷的单链核酸探针松散连接，然后加入戊二醛，在戊二醛的化学交联作用下与带负电荷的单链dna共价结合，从而标记dna。标记的探针dna与膜上的单链dna杂交形成双链dna，探针上的hrp在h2o2存在下，催化h2o2还原，同时使鲁米诺氧化并伴随蓝光产生，在增强剂的作用下使产生的光加强，从而可在x光片上检测。
首先将经限制性内切酶酶解的dna片段，经琼脂糖凝胶电泳分离以及在凝胶上经naoh处理使之变性，然后将尼龙膜(hybond-n+)放在凝胶上，使之按原有顺序将条带转移至膜上并固定起来，这是southern转膜过程。
southern膜杂交是将吸附并固定在hybond-n+尼龙膜上的dna片段与一个标记的探针杂交，zui后经过显影从x光片上显现出杂交分子的区带。
本实验中，经琼脂糖凝胶电泳分离的水稻基因组dna酶切产物，通过southern转移，将其吸印在hybond-n+尼龙膜上，通过辣根过氧化物酶直接标记探针，与膜上的水稻dna进行杂交，再用增强的化学发光方法得到分子杂交结果。
本实验所用的探针来源于水稻和大麦，具有抗病基因nbs-lrr结构特点的dna探针，因此水稻dna和探针之间有较好的同源性，可得到杂交带，可满足初学者对southern杂交方法进行训练。
【仪器、材料与试剂】
(一) 仪器
恒温水浴器 烤箱 台式高速离心机
琼脂糖凝胶电泳系统 高压灭菌锅 -70℃或-20℃冰箱
(二)材料
限制性内切酶 ecl试剂盒 (nacl)
柠檬酸钠 盐酸(hcl) 氢氧化钠(naoh)
蔗糖 硼酸 溴酚蓝
十二烷基硫酸钠(sds) 显影粉 定影粉
溴化乙锭(eb) 20μl, 100μl, 1000μl微量加样器及吸头，小指管
whatman 滤纸及普通滤纸 10 cm×5 cm玻璃板 尼龙膜(hybond-n+)
卫生纸(或吸水纸) 裁纸刀 杂交盒
500g重物 x光片夹及x光片 剪子、镊子、刀片、胶带
保鲜膜 一次性手套
(三)试剂
1. 20×ssc(1000 ml)：3 mol/lnacl(175.32g);0.3 mol/l柠檬酸钠(88.26g)，用1 mol/lhcl调至ph7.0
2. 变性溶液(500ml)：1.5 mol/lnacl(43.83g);0.5 mol/lnaoh(10g)
3. 中和溶液(500ml)：1.5 mol/l nacl(43.83g);0.25 mol/l naoh(5g)
4. 5×tbe(250 ml)：13.5g tris，6.9 g硼酸，0.9g edta-na2，用蒸馏水定容至250 ml
5. te(10ml)：10 mmol/ltris-hcl;1 mmol/ledta ph8.0
6. 0.25 mol/lhcl(500 ml)
7. 6×溴酚蓝载样液(1ml)：0.25%溴酚蓝;40%蔗糖
8. eb染色液：0.5 μl/l 溴化乙锭
【实验步骤】
(一)基因组dna的提取(略)
(二)样品的限制性酶切及酶切效果检查
1. 在1.5 ml 离心管中加入5 mg 基因组dna进行限制性酶切;加入1/10终体积的10×反应缓冲液和50u限制酶(如dra i)。加ddh2o至酶切反应终体积。将反应物按照厂商说明在适当温度温育(如37℃下反应过夜)。
2. 取10%或更少体积已酶解的温育混合物，用0.5×tbe缓冲液于0.8%琼脂糖胶上进行电泳，片段分开及染色后，可见dna弥散带。部分酶解的样品dna在胶的顶端可见一条未酶解的带，已酶解的dna弥散带亮度较弱。根据不同道上弥散带亮度，调节dna量以确保有等量的dna进行电泳。
(三)southern转移(以下操作要戴上一次性手套)
1. 将酶解的dna样品小心加入0.8%琼脂糖胶的加样孔中。各取20ng 1kb plus和control dna (hindiii酶切的λdna)梯度标准参照物，分别与6×加样缓冲液混匀后加入*与zui后一个加样孔中。以25v电泳24~48 h。
2. 将琼脂糖胶浸入0.25 mol/l hcl溶液中10 min(至溴酚兰由蓝色变桔黄色)，使dna脱嘌呤。
3. 将胶浸入变性液(0.5 mol/l naoh、1.5 mol/l nacl)中变性30 min，使dna双链变性成单链。
4. 将胶浸入中和液(0.25 mol/l naoh、1.5 mol/l nacl)中平衡20 min。
5. 准备一个供dna从胶上向尼龙膜转移的玻璃平台。将一张0.2um的hybond-n+尼龙膜(英国amersham公司生产)和一张滤纸切成与待转移胶相同大小，另将一张滤纸切成与胶相同宽度，长度较长足以达到盛转移液盒子的底部。
6. 将较长的滤纸在转移液(0.25 mol/l naoh、1.5 mol/l nacl)中浸湿后置于平台上，两端浸入转移液中(使溶液不断地吸到滤纸上)。将胶置于滤纸上部，用玻璃棒仔细赶掉凝胶与滤纸间的气泡，用镊子将hybond膜置于胶上并用玻璃棒赶掉hybond膜与凝胶间的气泡，将剩下的滤纸在转移液中浸湿后置于膜上，再次赶尽气泡。放一叠卫生纸(与尼龙膜同样大小，约1000g)压在滤纸上部，再放相同尺寸的玻璃板，zui后放一重物(约500g)在玻板上，让凝胶上的dna转移12h或过夜。
7. 将尼龙膜与凝胶剥离，凝胶用eb染色后观察(胶上应无桔黄色荧光条带，说明dna转移*)。弃去胶，把尼龙膜浸在6×ssc溶液中，约5min后取出。
8. 将尼龙膜夹在4层普通滤纸中，置80℃烘箱中烤2 h，使已转移的dna与膜交联。
(四)探针标记
dna探针采用具有抗病基因nbs-lrr结构特点的探针(可通过pcr扩增制备)，用ecl系统(英国amersham公司生产)进行标记。取所需标记的dna探针于95℃变性5 min，冰浴5 min;然后加入与探针等体积的dna标记试剂(带正电荷的辣根过氧化物酶聚合体)和化学交联剂戊二醛溶液;混匀并短暂离心后37℃保温10 min，放于冰上备用。
(五)southern杂交
1. 将已烘烤过的膜放入杂交盒中，加入预热的含有0.5mol/l nacl和5%封闭试剂的杂交液(英国amersham公司生产)，使杂交液刚好没过尼龙膜，置于42℃预杂交1h(预杂交的目的是防止标记的探针与尼龙膜非特异性结合，从而使背景更清晰)。
2. 加入已标记的探针，混匀后于42℃杂交过夜(变性探针与膜上的特异性序列杂交)。
3. 弃杂交液，以55℃初洗液(0.4% sds, 0.5×ssc)漂洗两次，每次10min，弃初洗液后，用2×ssc再漂洗两次，各5 min(洗膜目的是将尼龙膜上未与dna杂交的及非特异性杂交的探针分子从膜上洗去)。
4. 尼龙膜稍作吸印或晾干过多的漂洗液后，加等量的观察液1(h2o2)和观察液2(鲁米诺及增强剂)处理膜1分钟。
5. 移去过多的观察液，用保鲜膜包好尼龙膜，置于x光片夹中。
6. 在尼龙膜上压上x光片曝光1-2小时(在暗室中进行)。
7. 冲洗x光片(显影一水洗一定影)，分析杂交条带。所得数据用统计软件进行聚类分析。