多光子荧光显微镜是一种功能强大的研究工具，将激光扫描显微镜的*光学技术与长波长多光子荧光激发相结合，可捕获标有高特异性荧光团的标本的高分辨率三维图像。
该方法对于致力于研究活细胞和组织中动态过程而不会对标本造成重大且通常是致命性损害的细胞生物学家特别有用。尽管经典的宽视野荧光显微镜通常可以提供生命系统中生物化学事件的亚微米分辨率，但由于背景噪声的存在，整个背景位于焦平面之上和之下，因此该技术的灵敏度和空间分辨率受到了局限性的限制。
多光子显微镜中的激发仅发生在衍射极限显微镜的焦点处，从而提供了对厚的生物样本进行光学切片以获得三维分辨率的能力。单个光学部分通过在xy平面上对样本进行光栅扫描来获得x射线，并且通过在连续的z位置上依次扫描样本来构成完整的三维图像。因为可以精确确定和控制焦点的位置，所以多光子荧光可用于探测样品表面以下的选定区域。高度局部化的激发能可地减少附着在标本上的荧光团的光漂白并降低光损伤，从而增加细胞活力以及随后的研究活细胞特性的实验持续时间。另外，近红外激发波长的应用允许更深地渗透到生物材料中，并减少了在较短波长下观察到的高度光散射。
图1说明了在多光子荧光显微镜实验中使用的典型配置。显微镜是倒置式仪器，旨在观察组织培养物中的活细胞以及浸入盐水溶液的较厚的生物样本。对于常规的非荧光观察，可在台架上方放置一个透明的灯箱，以通过常规技术（例如明场，微分干涉对比，相位对比和霍夫曼调制对比）可视化标本。尽管在多光子应用中没有用，但一个35毫米的相机主体连接到了图1所示的显微镜前基座的端口上，以捕获使用常规照明拍摄的图像。显微镜主体的右边是钛（ti）：蓝宝石锁模脉冲激光系统由于具有较高的峰值强度但平均功率较低，因此是多光子激发的光源之一。激光的控制是通过位于激光柜顶部的电子单元完成的，该电子单元通过与光波导的光纤耦合或与战略放置的中继镜的直接耦合与显微镜端口相连。过滤后的光电倍增管检测系统与xy光栅扫描单元连接到显微镜基座的另一个端口，该xy光栅扫描单元可以使聚焦的激光束快速偏转穿过物镜。显微镜收集的数字图像由附带的计算机工作站进行处理和分析，该工作站可以从光学部分组装三维重建物。
传统的宽视场荧光显微镜受到远离焦点区域的二次荧光的困扰，这会导致天赋和高背景噪声信号，从而经常掩盖重要的标本细节。共聚焦显微镜通过使用针孔来排除散焦的背景荧光，从而在很大程度上避免了这个问题，针孔可从厚样品的深处产生薄的（小于微米）未模糊的光学切片。多光子荧光显微镜的引入通过选择性激发与更广泛的检测选择相结合，为共聚焦显微镜提供了新的选择。与传统的共聚焦显微镜不同，图1所示的显微镜在检测器附近不需要针孔即可实现三维识别，大大提高了发射荧光信号的效率。过去，多光子激发所需的脉冲激光系统的高成本和复杂性限制了该技术的使用，但是近引入的交钥匙激光器和商用多光子系统已使多光子荧光显微镜成为许多研究的方法。
双光子和三光子激发
玛丽亚·格珀特·梅耶（mariagöppert-mayer）在70年前进行博士论文研究时首先描述了多光子激发的基本原理，但直到30年后才发明脉冲红宝石激光器，这一假设才得以证实。在高光子密度下，两个光子可以通过组合其能量来激发荧光团向激发态的电子跃迁，从而同时被吸收（由虚拟状态介导）。因为光子的能量与它的波长成反比，所以两个光子的波长应约为单光子激发所需波长的两倍。举例来说，两个波长为640纳米（红光）的光子可以结合在一起，以激发320纳米区域（紫外线）中吸收紫外线的荧光团，这将导致更长（蓝色或绿色）波长的二次荧光发射。这种*的应用意味着，可以很方便地利用延伸到红外区域的更长波长在单个量子事件中激发发色团，随后发出更低波长的二次辐射。
每个激发事件需要两个光子，因此需要一个速率常数，该常数取决于激发强度的平方。尽管光子不必具有相同的波长才能引发多光子激发，但是大多数实验系统都设计有单个激光源，因此两个光子通常是具有窄波长分布的定义种群的成员。与单光子吸收的情况不同，给定的荧光团将同时吸收两个光子的概率是入射光子之间的空间和时间重叠的函数。基于这样的假设，每个荧光团暴露于相同的激光的横截面的计算表明，光子必须10（-18）秒内到达（一个atto第二）。此重叠周期的时间标度与中间虚拟状态的寿命（10（-17）秒或0.01 飞秒）一致。
在多光子荧光中，高光子密度是必需的，以确保足够水平的荧光团激发。实际上，光子浓度必须是等效数量的单光子吸收所需光子浓度的大约一百万倍。这是通过高功率锁模脉冲激光器完成的，该激光器在脉冲峰值期间产生大量功率，但平均功率足够低，不会损坏样品。在恒定的平均入射激光功率水平下，激光发出的短暂但强烈的脉冲会增加给定荧光团的平均双光子吸收概率。小化平均激发功率水平会减少单光子吸收的数量，这在激发过程中也会在样品中发生。
对于多光子荧光实验，典型的脉冲激光器配置采用约100飞秒（10 e（-13）秒）的短占空比，重复频率为80至100兆赫。该方案允许令人满意的图像采集，而不会使样品受到过多的热量和光损伤。每个脉冲的时间标度通常被称为“超短”，但仍比双光子吸收的反应时间长四到五个数量级。由双光子脉冲激发的生色团中的单态态的种群与常规的宽视野或共聚焦荧光显微镜观察的种群相同。因此，双光子激发后的二次荧光发射与单光子实验中观察到的没有区别。
三光子激发是一种相关的非线性光学吸收事件，可以类似于二光子激发的方式发生。不同之处在于，三个光子必须同时与荧光团相互作用才能非法过渡到激发单重态。三光子激发的好处是，成功的吸收仅需要比二光子吸收高十倍的光子浓度，这使该技术对某些实验具有吸引力。三光子激发可以比双光子吸收更大程度地增强z轴分辨率。这是由于需要与三个单独的光子同时相互作用而导致的荧光团激发的横截面较小。在实践中，发射波长中心为1050纳米的红外光的激光能够激发在紫外区域（约350纳米，激发波长的三分之一）吸收的荧光团。同一激光可以同时激发另一半波长（525纳米）的荧光团，这在双标记生物学实验中非常有用。
通过利用较短的近红外波长（低至720纳米），三光子荧光可以将有用的荧光成像范围扩展到深紫外线。900至700纳米范围内的激光波长将激发在240至300纳米范围内吸收的荧光团，而使用传统的显微镜光学装置实际上是无法达到的。用于制造荧光物镜的玻璃对于300纳米以下的波长具有非常低的透射率，但是较长波长的红外激光辐射很容易通过以产生三光子激发。
常见芳香族氨基酸*的单，双和三光子激发示意图如图3所示。一个4.5电子伏特的单光子电子跃迁在280纳米处激发*，随后在348纳米的紫外线中发射二次荧光。区域。双光子机制的激发是通过以580纳米为中心的黄绿色的光完成的，而当氨基酸在840纳米辐射的近红外区域照射时，会发生三光子激发。跃迁以jablonski图（图3）表示，其中虚拟状态由用于两个光子激发的球体和用于三个光子激发的两个球体表示。*比其他芳香族氨基酸具有更强的荧光和更高的量子产率，并且在大多数蛋白质中仅少量存在。这些属性应使多光子显微镜成为使用*残基自发荧光进行研究的出色工具。甚至更高阶的非线性现象都是可能的，包括四光子激发，但这些现象尚未应用于生物学研究。
双光子荧光显微镜
因为在这里光子密度，所以发生了在多光子显微镜中将激发定位到紧邻焦点的区域。该优点来自于基本的物理原理，即荧光团的双光子吸收是激发强度平方的函数。当来自脉冲激光源的光子被高数值孔径的物镜聚焦时，它们变得更加拥挤，从而增加了两个或多个光子同时与单个荧光团相互作用的可能性。光子在显微镜焦点处的聚集对于吸收多光子至关重要，因此这是发生明显激发的区域。该概念在图2和4中给出，它们分别在宏观和微观层面上说明了多光子激发。图2是显微镜物镜在显微镜载玻片和盖玻片上对培养的细胞成像的位置的放大图。红色激光脉冲穿过物镜的纵轴，并聚焦并集中到图中心部分的像元上。
在图4中，在显微镜焦点处证明了光子拥挤以及与荧光团的相互作用。当红色激光脉冲穿过包含荧光团（表示为球的线性三重态）的样品时，激发的可能性随着脉冲到达物镜的焦点而增加。各个光子表示为聚集体，这些聚集体被分成散布的红线，这些红线定义了激光脉冲的边界。定位在图4中焦点区域中心的一小组荧光团分子已被两个光子的同时吸收所激发，并呈现绿色的次级荧光。焦平面外的生色团吸收两个光子的可能性几乎为零，因为该区域的光子密度不够高。
双光子激发的现象之所以可能，不仅是因为荧光团在显微镜焦点处的空间接近性，而且还因为连续激光脉冲中包含的光子在时间上的重叠。如上所述，双光子吸收中的激发能量与激光源产生的光子强度的平方成正比。脉冲激光束强度随距焦平面的距离的平方而降低，因此，靠近焦距区域的任何地方的荧光团的激发概率都随荧光团距焦平面的距离的四次方而减小。脉冲激光照明锥的尺寸由物镜数值孔径确定。从而，远离焦点的光束强度降低与激发光圆锥的直径成正比。随着照明圆锥体在焦点上方和下方扩展，荧光团激发概率随圆锥体直径的四次方而减小。由于这个原因，荧光团激发被限制在焦点周围的直接区域内，该区域仅代表整个样本的非常薄的光学部分。
激光脉冲持续时间通常在大约100飞秒到1皮秒（10 e（-13）到10 e（-12）秒）的范围内，在宏观上被认为是超短的。但是，就光子吸收事件的时间标度（大约飞秒的千分之一）而言，脉冲的持续时间实际上很长。这限制了荧光团的饱和度，并允许分子有足够的时间在脉冲之间发生另一轮激发之前返回到基态。脉冲重复频率范围从80到120兆赫兹（mhz），可提供高瞬时峰值激励功率，其后的平均停留时间为10纳秒。由于典型的荧光团的荧光寿命仅持续几纳秒，激发分子的群体有足够的时间在脉冲之间放松。相对较短的脉冲占空比（脉冲持续时间除以脉冲之间的时间）将平均输入激光功率限制为小于10毫瓦，该值仅略大于常规用于激光扫描共聚焦显微镜的值。
与共焦显微镜相比，将双光子激发限制在焦平面附近的区域为多光子提供了显着优势。共聚焦显微镜在整个标本中激发荧光，但检测器收集的二次荧光被共聚焦针孔限制在物镜上。这用于减少背景噪声或来自其他焦平面的荧光的数量，这些噪声或焦平面将背景噪声添加到数据中。相反，多光子显微镜仅在焦平面处产生荧光激发（随后发出荧光），从而消除了背景信号和共焦针孔的必要性。共焦和多光子显微镜激发模式之间的显着差异如图5所示。
图5中显示的是xz光漂白图案，该图案是通过在用荧光染料若丹明染色（绿色染料）染色的formvar聚合物薄膜中重复扫描单个xy平面而产生的。左侧（图5（a））是通过使用共聚焦显微镜扫描染色的胶片而生成的轮廓。扫描中心的白色矩形表示焦平面，该焦平面穿过针孔并被检测器成像。从矩形的上，下角伸出的对角蓝线表示激发光束通过胶片所采取的光路。当光束光栅扫描胶片时，荧光染料被激发并发出二次荧光。终，发生光致漂白，这由焦点区域中的暗区表示。在通过共聚焦显微镜扫描的胶片中（图5（a）），在焦平面以上和以下的整个激发路径中，积分激发几乎相等。相反，多光子显微镜产生的xz重复扫描激发轮廓将激发和光漂白限制在焦平面上（图5（b））。与图5（a）的情况类似，从焦平面发出的对角蓝线勾勒出激发光到达焦平面的路径。
多光子显微镜提供的局部激发产生了许多优点。也许重要的是该技术可以实现的高三维分辨率，这与理想的共聚焦显微镜所获得的分辨率相同。而且，由于缺乏位于焦平面外的荧光团的吸收，使得更多的激发光可以穿透样品并到达聚焦平面。结果是聚焦光束穿透样品深处的能力显着提高，通常达到的深度范围可以是共聚焦显微镜观察到的2到3倍。
如先前所讨论的，随着沿光轴（z方向）的距离的四次幂，焦点区域之外的多光子吸收概率下降。当使用高数值孔径物镜（1.4）对均匀分布的荧光团进行多光子激发时，大约80％的吸收发生在一个紧密限定的空间（称为焦距）中。该体积的尺寸取决于物镜数值孔径，但是对于近红外波长下的典型大孔径荧光物镜，该区域由椭圆形定义，椭圆形的直径为0.3微米，轴向长度为1微米。
对于多光子显微镜，图5（b）中所示的光致漂白量（以及对细胞和组织的相关光损伤）的显着减少远小于共聚焦显微镜。光漂白和光损伤是荧光显微镜在活细胞，组织和其他生物研究中重要的两个限制。荧光团的激发引起基态电子向激发单线态能量态的促进。在从激发态的振动弛豫过程中，系统间交叉有可能发生三重态，而不是典型的衰减回到单重态。三重态非常活泼，而且寿命相对较长，这使得在这种条件下的荧光团能够与活细胞发生反应或经历分子变性或重排为非荧光物质。此外，三重态激发的荧光团可以产生单线态氧，该单线态氧将与相邻生物分子上的多种官能团反应。激发光必须在到达焦点的途中在所有焦平面上穿透样本，并且大多数这种光继续传播很远的距离超过焦点区域。因此，在整个光束路径中激发的荧光团（如在宽场和共聚焦显微镜中的情况）将经历大量的光漂白并产生细胞和组织损伤，而使用多光子技术可以避免这种损伤。三重态的激发荧光团可以产生单线态氧，该单线态氧将与相邻生物分子上的多种官能团反应。激发光必须在到达焦点的途中在所有焦平面上穿透样本，并且大多数这种光继续传播很远的距离超过焦点区域。因此，在整个光束路径中激发的荧光团（如在宽场和共聚焦显微镜中的情况）将经历大量的光漂白并产生细胞和组织损伤，而使用多光子技术可以避免这种损伤。三重态的激发荧光团可以产生单线态氧，该单线态氧将与相邻生物分子上的多种官能团反应。激发光必须在到达焦点的途中在所有焦平面上穿透样本，并且大多数这种光继续传播很远的距离超过焦点区域。因此，在整个光束路径中激发的荧光团（如在宽场和共聚焦显微镜中的情况）将经历大量的光漂白并产生细胞和组织损伤，而使用多光子技术可以避免这种损伤。并且大多数这种光继续通过焦点区域传播相当远的距离。因此，在整个光束路径中激发的荧光团（如在宽场和共聚焦显微镜中的情况）将经历大量的光漂白并产生细胞和组织损伤，而使用多光子技术可以避免这种损伤。并且大多数这种光继续通过焦点区域传播相当远的距离。因此，在整个光束路径中激发的荧光团（如在宽场和共聚焦显微镜中的情况）将经历大量的光漂白并产生细胞和组织损伤，而使用多光子技术可以避免这种损伤。
尽管对光照射引起的细胞损伤的确切机制了解甚少，但已经确定减少的光损伤将大大延长荧光显微镜研究的生物样品的生存能力。单独暴露于长波可见光和近红外光似乎不会影响细胞生存力，因此，与多光子显微镜相关的大部分损伤很可能是由激发引起的，并且仅限于焦平面。
多光子显微镜检测器
在多光子显微镜中，通过二次荧光发出的光子几乎*来自物镜焦平面，从而消除了对去扫描检测的需求，并允许更灵活的检测几何形状。与共聚焦显微镜相比，这种增加的多功能性可以导致荧光检测效率的显着提高。在具有去扫描检测功能的系统中，物镜收集的光在穿过针孔到达检测器之前会从一系列扫描镜的表面反射。在增加图像分辨率的同时，共焦针孔会大大降低检测效率，并需要将标本长时间暴露在入射光下，从而增加了光损坏和光漂白的可能性。
在某些情况下，可能需要将改进的共聚焦检测技术应用于多光子成像（图7）。可以通过使用大的共聚焦针孔来排除进入室内的光线，这会导致横向分辨率略有提高，但会降低信号收集效率。针孔还可以利用具有小入射孔的检测器，例如雪崩光电二极管或光谱仪。在实施之前，应仔细检查针孔用于多光子成像的情况。样品发出的许多有助于成像的光将被针孔遮挡。这既包括从焦平面内的位置散射的光，也包括源自焦点区域边界的光。出于同样的原因，从样品深处收集的荧光量也将减少。实际上，当使用共聚焦针孔孔径时，对于多光子和共聚焦成像，在样品深度增加时信号衰减将相似。
图7中显示了几种检测图案，这些图案说明了使用光电倍增管（pmt），ccd图像阵列检测器和非光学检测来收集荧光信息。光电倍增管是多光子荧光显微镜中的检测器，因为可以使用这些设备有效捕获较短的发射波长（紫外线和可见光的低波长）。图7中各种标量光电倍增管探测器之间的主要区别是发出的荧光是通过扫描镜传回（反扫描检测）还是通过传输透镜中继到与物镜后孔径共轭的平面中的探测器（pmt）。第三个光电倍增管（标为外部如图所示，检测器位于样品的右下角，旨在直接从样品中捕获荧光，而无需通过显微镜光学系统的任何部分。
由于分辨率是由多光子激发过程定义的，因此无需使用物镜就可以收集激发的荧光团发出的光。实际上，高数值孔径的聚光器将足以达到为检测器积累二次荧光发射的目的。在某些情况下，将光电探测器放置在从显微镜光学镜上移开的区域中的样品上方（或下方，具体取决于显微镜配置）（图7）。这种检测方案可以利用短波长发射，该波长可能会因通过物镜的低透射率而受到阻碍或阻止。另一种策略是使用探测器直接从物镜收集发射（例如整个区域）。光电倍增管，如上所述）放置在二向色镜附近，该二向色镜通过传输透镜反射来自后孔的光。较短的发射路径有利于收集光子的数量，特别是在通过浸在盐水中的十到二十微米的组织成像时。尽管可以采用后一种方法来地提高荧光检测效率，但它通常容易受到环境室内光的污染。
光电二极管阵列，例如电荷耦合器件（ccd）或互补金属氧化物半导体（cmos）检测器，也可用于在多光子实验中收集荧光信息（图7）。在这种配置中，样本发出的光再次从二向色镜反射并直接成像到光电二极管阵列表面上，该光电二极管阵列表面放置在与中间像平面共轭的平面中。由于分辨率是由发射波长决定的，该波长比激发波长短，因此通常可以通过这种技术获得横向分辨率的提高。
由于激发过程中的高度空间定位，几种非光学检测方案有可能应用于多光子显微镜。其中包括光声检测（用于测量少量吸收）和扫描光化学检测（可从电压钳位的细胞中的离子电流生成受体分布的图像）。
多光子显微镜的分辨率
多光子显微镜的分辨率不超过共聚焦显微镜所能达到的分辨率，实际上，更长波长（红至近红外； 700至1200纳米）的利用导致了多光子激发的更大的点扩散函数。这转化为横向和轴向分辨率的略微降低。例如，在700纳米的激发波长和1.3数值孔径的物镜下，观察到的横向分辨率约为0.2微米，相应的轴向分辨率为0.6微米。当与stoke的位移大小耦合时，这些值的范围可能比在相同条件下使用常规共聚焦显微镜观察到的分辨率大30％。实际上，由于有限的针孔孔径，色差，以及光学系统的不*对准，所有这些都有助于减小共焦和多光子显微镜之间的分辨率差异。从讨论中可以明显看出，如果用共聚焦显微镜不能充分分辨结构，则在用多光子激发成像时，它们的性能将不会更好（可能会更差）。
在采集数字图像或对具有三维空间分辨率的光子进行计数时，必须将焦点体积内发生的荧光发射与背景中产生的荧光区别开。可以通过仪器（使用共焦或多光子仪器）或通过对三维数据集进行反卷积来实现两个信号之间的区分。区分焦平面的荧光发射和背景荧光的能力由信噪比（s / b）定义，其中s是从焦平面和b收集的光子的数量或强度代表源自背景的光子（离焦平面）。在共聚焦扫描显微镜中，通过共聚焦针孔排斥背景信号会产生高s / b比。但是，在多光子激发中，s / b比值本来就很大，因为在焦平面外几乎没有激发。在进行共焦计算时，可以通过考虑一个无限小的针孔来比较多光子与共焦技术之间的分辨率计算。对于这两种技术，信噪比通常比经典的宽视野荧光显微镜大几个数量级。
要考虑的另一点是，多光子激发能够利用在低波长紫外区域具有吸收跃迁的荧光团。由于共聚焦显微镜激发低于340纳米的荧光团的能力受到限制，因此研究人员倾向于使用波长更长，分辨率更低的探针。在紧急情况下，可以通过限制共聚焦针孔的成像波长来提高多光子显微镜的分辨率，还可以利用空间分辨的检测系统（例如放置在扫描图像平面中的ccd光电二极管阵列）来提高分辨率。
荧光团的激发特征
多光子实验中使用的荧光团应与用于单光子研究的荧光团进行同样的审查。探针应在方便的波长下具有较大的吸收截面，具有高的量子产率，较低的光漂白速率以及低的化学和光化学毒性程度。荧光团还应该能够承受来自激光源的高强度照明而不会出现明显的降解。在大多数情况下，研究人员已将相同的普通荧光团用于双光子实验，广泛用作宽视野和共焦荧光显微镜中的标记物。
普通荧光团的激发光谱是激发模式和入射光子波长的函数。由于这种依赖性，双光子吸收光谱可能（并且经常）与相应的单光子光谱有很大的不同。实验上，已检查的大多数荧光团均能够以两倍于其单光子大吸收波长的波长吸收双光子激发。尽管如此，没有简单的通过检查单光子截面来定量预测复杂荧光团的双光子激发光谱的基础。对于高度共轭的非对称分子，单光子激发光谱和双光子激发光谱之间通常存在显着差异，在分子光谱学中经常使用它们来提供有关激发态结构的信息。一个很好的例子是芳香族氨基酸衍生物*和苯*，其复杂的双光子截面与单光子激发所显示的截然不同。相比之下，*的双光子光谱（图2）与单光子激发显示的曲线非常相似。
对于定量三维重建和解卷积实验，应测量荧光团的双光子吸收光谱，以确保激发波长位于吸收带中峰值附近。尽管可以计算出两个光子的横截面，但此过程充其量是复杂的。吸收光谱的直接实验测量是方法，但是由于吸收的入射功率相对于光源的强度波动较小，因此这些实验很困难。已经采用热透镜法和声光技术确定吸收截面，但也许更简单的方法是检查具有已知量子产率的荧光团的光子发射。在设计新的双光子实验时，
图7给出了许多常见荧光团的双光子荧光激发光谱的测量特性。图7中的数据表示双光子作用截面，该截面是通过将荧光发射量子效率与双光子吸收截面的乘积得出的。利用锁模的ti：蓝宝石激光器发出的线性偏振光记录光谱。在每个光谱中，黑点表示荧光团大单光子吸收波长的两倍。表1是图7中每个光谱旁边显示的两个字母名称代码的关键。曲线表示荧光团双光子激发的光谱截面。
荧光团的双光子荧光激发光谱荧光团名称
（缩写）
激发波长（nm）
(bm)p-bis(o-methylstyryl) benzene
691
(cb)cascade blue hydrazide trisodium salt
750
(yl)lucifer yellow ch ammonium salt
860
(bd-bodipy) 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a, 4a-diazaindacene-2,6-disulfonic acid disodium salt
920
(dp-dapi not dna bound) 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride
700
(dn-dansyl)5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl hydrazine
700
(py)1,2-bis-(1-pyrenedecanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine
700
(cm)coumarin 307
776
(ic)indo-1 with ca++
700
(if)indo-1 without ca++
700
(fc)fura-2 with ca++
700
(ff)fura-2 without ca++
720
(cg)calcium green-1 with ca++
725
(co)calcium orange with ca++
800
(cc)calcium crimson with ca++
850
(f3) fluo-3 with ca++
800
表格1
横截面测量表明了一个趋势，其中两个光子吸收的激发峰相对于单光子曲线非常相似或发生了蓝移（图7）。较短的平均波长可能有利于将荧光团激发耦合到锁模激光器的可用波长范围。双光子吸收光谱的另一个一致方面是，它们通常比单光子吸收光谱宽得多。这通过增加适合激发的波长范围来减轻实验限制，并增强了同时激发两个具有重叠的两个光子横截面，但相距很远的单光子光谱的荧光团的能力。
尽管对于单光子激发和双光子激发，吸收光谱通常会有所不同，但是其他荧光特性（例如寿命，发射波长和系统间交叉速率）似乎并未受到影响。这种相似性表明，通过线性或非线性吸收可以达到相同的荧光激发态，并且一旦荧光团被激发，无论激发模式如何，其行为都将相同。这些租户还持有三光子激发光，从而使研究人员能够在大多数多光子实验中利用*的比率和光谱方法。
多光子激发中的光和热损伤
所有形式的荧光显微镜都对活细胞造成光损伤，其程度取决于激发波长，曝光时间长短以及用作细胞探针的荧光团的化学性质。激发照明引起的损害可分为两类：热损害和由于化学反应引起的降解。由于荧光团激发，由生物化学反应引起的光化学副作用尚未得到很好的理解，并且在细胞和组织类型之间差异很大。另一方面，热损伤主要由两种机理引起，这两种机理是由于水的单光子吸收和焦点区域中的荧光团的双光子吸收。
在大多数研究的细胞（尤其是哺乳动物细胞）中，用于多光子荧光的内在荧光团几乎不吸收长波长的近红外激发辐射。但是，细胞和组织周围的细胞内和细胞间水可以吸收大量的红外线和近红外光，产生过多的热量，这有可能损害生物样本的生存能力。另一方面，当用共焦和宽场荧光显微镜中使用的较短可见光和紫外线波长照射水性生物环境时，周围的水不会吸收大量的热量。
由于水的单光子吸收，在焦平面之上和之下的整个光束路径中都会发生加热。在受控的平均多光子条件下，已计算出在700纳米和1000纳米分别引起的温度升高范围在0.065到1.1摄氏度之间。这些计算与使用光学镊子激光激发在1064纳米进行的热量测量结果一致。在激发光束保持静止的情况下，可能会产生更大的热量，并随着时间呈对数关系迅速上升。在多光子激发实验中，由于荧光团吸收引起的加热高度局限在焦点区域。随后的热释放在围绕焦点体积的球对称区域内均匀地发生
结论
多光子荧光显微镜正成为活细胞和组织动态成像的一种选择方法。该技术在生物系统中特别有用，在该生物系统中，由于光学系统的透光特性，否则将无法进行紫外线激发。另外，在多光子激发中，诸如光漂白和光损伤的副作用被小化，并且仅在聚焦体积周围的紧邻区域中发生。尽管对普通荧光团的双光子吸收曲线的预测和测量正在缓慢完成，但该领域的大量工作尚待完成。专门针对多光子激发的新型荧光团的设计仍处于胚胎阶段，
细胞中的光毒性是一个鲜为人知的现象，但是在大多数形式的荧光显微镜中确实会发生。在多光子显微镜中，较低的量子能和较低的较长波长的固有吸收较低，可减少光对活细胞和组织的有害影响，为细胞动力学的新研究打开了大门。多光子显微镜研究的主要障碍是设备的高成本，特别是双光子和三光子激发所需的必要的锁模脉冲激光系统。通用的超快激光系统的两种主要类型是ti：蓝宝石激光器和nd：ylf激光器，尽管它们非常昂贵，但不需要水冷，也不需要过多的电力。ti的波长可调性：蓝宝石脉冲激光器（700至1100纳米）使其比单波长nd：ylf激光器（1047纳米）具有更多的用途，但是可调性的便利性使其无法进行手动操作。随着更新，便宜和用户友好的激光器被引入竞争市场，更多的商业多光子显微镜系统将以更便宜的价格被引入。这种可用性，加上对多光子荧光的实现没有物理限制的事实，将鼓励该技术在整个生物科学中的广泛应用。并且将人性化的激光器引入竞争激烈的市场，将以更便宜的价格引入更多的商用多光子显微镜系统。这种可用性，加上对多光子荧光的实现没有物理限制的事实，将鼓励该技术在整个生物科学中的广泛应用。并且将人性化的激光器引入竞争激烈的市场，将以更便宜的价格引入更多的商用多光子显微镜系统。这种可用性，加上对多光子荧光的实现没有物理限制的事实，将鼓励该技术在整个生命科学中的广泛应用。