咱们选用两株克己的单克隆抗体建立了夹心法elisa用于检测il-8,敏感性可达156pg/ml,操纵俭朴 ,重复性杰出,可用于il-8的根底和临床研讨。在严峻感染病人的血清中、炎症部分渗出液中都可检测到高水平的il-8。此外,近年来的研讨标明,il-8可能与各种安排缺血后再灌注损害的发作有关,包被缓冲液、pbs、底物缓冲液配制同惯例elisa法。封闭液或抗体稀释液应新鲜配制或冻存,注意事项待检标本如为血清,应选用一次性容器,血液收集后赶快(6小时以内)别离血清。原理选用两株辨认不同表位的抗il-8单克隆抗体,其间一株(4d7)作为包被抗体,以辨认和结合待检标本中的il-8,另一株作为酶标抗体,与结合于包被抗体的il-8的另一个表位结兼并催化底物显色。试剂器件包含elisa试剂盒供给包被抗体、酶标抗体、尺度品,底物(abts)、96孔elisa板。il-8是一种分子量为8~10kd的多肽,对嗜中性粒细胞,t淋巴细胞、嗜硷性粒细胞具有趋化效果,并可激活嗜中性粒细胞,是一种重要的炎症介质。
操作步骤
1. 包被:ph9.5 碳酸盐缓液稀释4d7单克隆抗体粗提γ球蛋白至1μg/ml,参加96孔板,100μl/孔,放4℃,36小时。
2. 封闭:0.1%吐温pbs(buffer a)冲刷96孔板三次,加3%bsa buffer a(buffer b)200μl/孔,放37℃,1小时。
3. 加待检样品:buffer a 冲刷96孔板三次,加待检样品及buffer b 稀释的规范品100μl/孔,放37℃,3小时。
4. 加酶标抗体:buffer a冲刷96孔板五次,3%peg buffer a稀释酶标抗体至1∶800,参加96孔板,100μl/孔,放37℃,1小时。
5. 显色:buffer a冲刷96孔板五次,ph5.4柠檬酸缓冲液溶解底物(abts),0.2mg/ml,加3%h2o2,2μl/ml,参加96孔板,100μ/孔,室温下或37℃显色。
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