annexin v pe/7-aad 凋亡检测试剂盒
产品货号: ba1984
产品规格: 20t/50t/100t
产品简介：
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（ps）从细胞膜内转移到细胞膜外，使ps暴露在细胞膜外表面。ps是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使ps暴露在细胞膜外。annexin v具有易于结合到磷脂类如ps 的特性，对ps有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的ps。ps转移到细胞膜外不是凋亡所的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以采用annexinv与7-aad双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。
产品组成：
产品名称
20t
50t
100t
保存条件
4× (binding buffer 4×)
4ml
10ml
20ml
2-8℃
7-aad viability staining solution
0.2ml
0.5ml
1.0ml
2-8℃
rhannexin v/pe
0.1ml
0.25ml
0.5ml
2-8℃
操作步骤（仅供参考）：
1. 细胞样品的准备：
a) 对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含edta的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的pbs，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；
b) 对于悬浮细胞：1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的pbs，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清；
2. 用去离子水按1:3稀释结合缓冲液(4ml 4×结合缓冲液+12ml去离子水)；
3. 用1×结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1-5×106 /ml；
4. 取100µl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5µl annexin v/pe混匀后于室温避光孵育5分钟；
5. 加入10µl 20ug/ml的7aad，并加400µl pbs，立刻进行流式检测。
实验设计：
1）未转染细胞
空白管：阴性对照组细胞，不加annexin v/pe，7aad，用于调节电压。
单染管：阳性对照组细胞，只加annexin v/pe或只加7aad，用于调节补偿。
检测管：处理的细胞，加annexin v/pe，7aad。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。 2）转染gfp
未转染空白管：未转染细胞，不加annexin v/pe，7aad，用于调节电压。
未转染单染管：未转染且有明显凋亡的细胞，只加annexin v/pe或只加7aad，用于调节补偿。
转染gfp空白管：转染gfp对照组细胞，不加annexin v/pe，7aad，用于调节补偿。
检测管：处理的细胞，加annexin v/pe，7aad。调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。
注意事项:
1. annexin v是与磷脂酰丝氨酸(ps)亲和，而ps在不同种属间没差异。在正常细胞中，ps只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，ps由脂膜内侧翻向外侧。
2. 低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2～3次，离心机4℃1000rpm 5min离心，处理得当的话，胰酶造成损伤可以控制在5%以内，有对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响。
3. 先加pi不仅染色是否每组都均匀充分很难判断，而且pi本身对细胞也是有毒性的，对实验结果影响会比胰酶大，不建议这样做。
4. annexin v是ca依赖的蛋白，所以不能加入edta，防止edta螯合了ca离子从而影响annexin v，进而影响结果。
5. 用流式检测凋亡时，7aad受时间的影响很大，因标记了7aad后会加大细胞毒性，随着时间延长会导致7aad的染色增加，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大。一般7aad加上后立刻上机，然后在一个小时内检测完成。两种方法都可以，但是按照我们操作步骤造成的误差会更小。
保存条件：2-8℃避光，勿冷冻。6个月有效。