gb 31656.4-2021食品安全国家标准
水产品中氯丙嗪残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
1范围
本文件规定了水产品中氯丙嗪残留检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于鱼、虾、蟹可食组织中氯丙嗪残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不ke少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
gb/t 30891-2014水产品抽样规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中残留的氯丙嗪，用乙腈提取，混合型阳离子固相萃取柱净化，液相色谱串联质谱测定，内标法定量。
5试剂和材料
以下所用试剂，除另有注明外均为分析纯，水为符合gb/t 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1乙腈（ch3cn）：色谱纯。
5.1.2甲醇（ch3oh）：色谱纯。
5.1.3甲酸（hcooh）：色谱纯。
5.1.4乙酸铵（nh4c2h3o2）。
5.1.5氨水（nh3·h2o）。
5.2标准品
5.2.1盐酸氯丙嗪（chlorpromazine hydrochloride，c17h20cl2n2s，cas号：69-09-0）：含量≥97.0%。
5.2.2盐酸氯丙嗪-d6（chlorpromazine-d6 hydrochloride，c17h14d6cl2n2s，cas号：1228182-46-4）：含量≥97.0%。
5.3溶液配制
5.3.1 5%氨化甲醇溶液：取氨水5ml、甲醇95ml，混匀。
5.3.2 2mmol/l乙酸铵溶液：取乙酸铵0.154 g，加甲酸1ml，用适量水溶解并稀释至1000ml。
5.3.3 30%甲醇-乙酸铵溶液：取甲醇30ml、2mmol/l乙酸铵溶液70ml，混匀。
5.4标准溶液制备
5.4.1 氯丙嗪标准储备液（100μg/ml）：取盐酸氯丙嗪标准品约11mg，精密称定，加甲醇适量使溶解并稀释定容至100ml容量瓶，摇匀，即得。-18℃以下避光保存，有效期6个月。
5.4.2内标储备液（100μg/ml）：取盐酸氯丙嗪-d6。标准品约11mg，精密称定，加甲醇适量使溶解并稀释定容至100ml容量瓶，摇匀，即得。-18℃以下避光保存，有效期6个月。
5.4.3 氯丙嗪标准中间液（500ng/ml）：准确量取氯丙嗪标准储备液适量，用甲醇稀释制成浓度为500ng/ml 氯丙嗪标准中间液。-18℃以下避光保存，有效期3个月。
5.4.4内标工作液（200ng/ml）：准确量取内标储备液适量，用甲醇稀释配制成浓度为200ng/ml氯丙嗪-d6。内标工作液。-18℃以下避光保存，有效期3个月。
5.5材料
5.5. 1混合型阳离子固相萃取柱：60 mg/3ml，或相当者。
5.5.2水相聚砜醚针式滤器：0. 22μm。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2天平：感量0.01 g和0.00001 g。
6.3均质机。
6.4离心机：6000 r/min。
6.5旋转蒸发仪。
6.6涡旋混合器。
6.7超声波清洗器。
7测定步骤
7.1试样的制备
按gb/t 30891-2014中附录b的要求制样。
a）取匀浆后的供试样品，作为供试试样；
b）取匀浆后的空白样品，作为空白试样；
c）取匀浆后的空白样品，添加适宜浓度的标准中间液，作为空白添加试样。
7.2试样的保存
-18℃以下保存，有效期3个月。
8测定步骤
8.1提取
取试样5 g（准确至±0.05 g）于50ml离心管中，加内标工作液50μl，加乙腈15ml，均质1 min，超声10 min，4 000 r/min离心7 min，将上清液转移至另一50ml离心管中；另取乙腈10ml清洗均质机30 s，洗液倒入残渣中，涡旋混合2 min，超声10 min，4 000 r/min离心7 min，合并上清液，6 000 r/min离心5 min，取上清液，备用。
8.2净化
取固相萃取柱，依次用甲醇、水各5ml活化，将上清液过柱，速度约为每秒1滴，用甲醇5ml淋洗，弃去流出液，抽干。用5%氨化甲醇溶液3ml洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹干。准确加入30%甲醇-乙酸铵溶液1ml溶解残留物，用水相针式滤器过滤至进样小瓶中，供液相色谱-串联质谱测定。
8.3基质标准曲线的制备
准确量取适量500ng/ml 氯丙嗪标准中间液和200ng/ml内标工作液，40℃氮气吹干，用空白基质液配制成同位素内标物浓度为10ng/ml，氯丙嗪浓度为2.5ng/ml.5.0ng/ml.25.0ng/ml、100.0ng/ml和250.0ng/ml的系列基质标准工作液，供液相色谱-串联质谱测定。以氯丙嗪特征离子质量色谱峰面积与同位素内标物特征离子质量色谱峰面积比值为纵坐标、相应的浓度为横坐标绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
8.4测定
8.4. 1液相色谱条件
a）色谱柱：c18柱，150 mm×2.1 mm，5μm，或性能相当；
b）流速：0.2ml/min；
c）柱温：25℃；
d）进样量：25μl；
e）流动相：a为甲醇，b为2mmol/l乙酸铵，梯度洗脱条件见表1。
8.4.2质谱条件
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测；
d）喷雾电压：4500 v；
e）离子传输毛细管温度：300℃；
f）源内碰撞诱导解离电压：8 v；
g）雾化气流速：12.3 l/h；
h）辅助气流速：1.7 l/h；
i）母离子、子离子和碰撞能量参考值见表2。
8.4.3测定法
取试样溶液和基质标准工作液等体积进样，作单点或多点校准，以色谱峰面积定量，内标法计算。基质标准溶液及试样溶液中氯丙嗪的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。通过试样中待测物的保留时间、特征离子相对丰度与浓度相近的基质标准溶液的保留时间、特征离子相对丰度相对照定性。试样液中待测物与标准品的保留时间偏差在±2.5%以内；特征离子相对丰度偏差满足表3的要求，则可判定试样中存在相应的被测物。在上述色谱-质谱条件下，氯丙嗪及内标标准溶液特征离子色谱图见附录a。
8.5空白试验
取空白试料，除不加标准溶液外，采用相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中氯丙嗪的残留量按公式（1）计算。
式中：
x——试样中氯丙嗪残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
c——从标准曲线计算得到的试样溶液中氯丙嗪浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
v——溶解残余物所用体积的数值，单位为毫升（ml）；
f——稀释倍数；
m——供试试样质量的数值，单位为克（g）。
10方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法检出限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg。
10.2准确度
本方法氯丙嗪在1μg/kg~50μg/kg添加浓度范围内，回收率为70%~110%。
10.3精密度
本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。