猪圆环病毒通用型(pcv-ⅰ)核酸检测试剂盒检测常见问题
1. cdna产量的很低可能的原因:
1) rna模板质量低
2) 对mrna浓度估计过高
3)反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
4)同位素磷32过期
5)反应体积过大,不应超过50μl
2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
1)常见的原因在于您的反应体系是pcr的反应体系而不是rt-pcr的反应体系
3) 与反应起始时rna的总量及纯度有关
4) 建议在试验中加入对照rna
5) 链的反应产物在进行pcr扩增时,在总的反应体系中的含量不要超过1/10
6) 建议用oligo(dt)或随机引物代替基因特异性引物(gsp)用于链合成。由于rna模板存在二级结构,如环状结果,有可能导致gsp无法与模板退火;或ssⅱ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。
7) 目的mrna中含有强的转录中止位点,可以试用以下方法解决:
a. 将链的反应温度提高至50℃。
b. 使用随机六聚体代替oligo(dt)进行链反应。