普鲁士蓝染色试剂盒(perls stain,中性红法)的应用！
一、背景
普鲁士蓝染色试剂盒(perls stain,中性红法)用于三价铁染色,含铁血黄素染色。普鲁士蓝染色试剂盒(perls stain,中性红法)主要由亚铁中性红组成,染色结果为：三价铁或含铁血黄素呈蓝色,其他呈红色。
含铁血黄素（hemosiderin）是一种血红蛋白源性色素，为金黄色或棕黄色颗粒，因其含铁、金黄色，故称为含铁血黄素。当红细胞被巨噬细胞吞噬后，在溶酶体酶的作用下，血红蛋白被分解为不含铁的橙色血质和含铁的含铁血黄素。
perls普鲁士蓝反应（prussian blue reaction）又称为含铁血黄素染色，即经过亚铁和稀酸处理后可以产生蓝色，常见于吞噬细胞内会间质内，主要显示三价铁盐。
perls普鲁士蓝是非常经典的组织化学反应，是显示组织内三价铁的一种敏感、传统优良的方法，其染色原理为：亚铁溶液使三价铁离子从蛋白质中被稀盐酸分离出来，三价铁与亚铁反应，生成一种不溶解的蓝色化合物即三价铁的亚铁普鲁士蓝，所以该反应被称为普鲁士蓝反应。
三价铁的亚铁是一种很稳定的化合物，在反应后可用红色染色剂进行复染，如核固红、伊红、中性红等。
二、石蜡切片染色操作步骤
1、组织固定于10%中性福尔马林，常规脱水包埋。
2、切片厚度4um，常规脱蜡水。
3、蒸馏水洗1min.。
4、切片入perls stain（见注意事项4），浸染15～30min
5、蒸馏水充分冲洗2～5min。
6、入中性红染色液，淡染细胞核15～30s。
7、自来水冲洗1～5s。
8、常规脱水透明，中性树胶封固。
三、应用
用于肿瘤特异性启动子peg3驱动报告基因fth1在干细胞瘤变时表达及mr成像研究：
将肿瘤特异性启动子peg3与mri报告基因fth1相结合,构建peg3-fth1-lv慢病毒载体,将peg3-fth1系统转入大鼠骨髓间充质干细胞（mscs）内,并诱导mscs瘤变,在诱导前后观察fth1基因表达、聚铁效应以及mri信号改变,探究利用peg3启动子驱动mri报告基因fth1在干细胞瘤变时特异性表达及聚铁,并被mri检测的可行性。
方法：
1、peg3-fth1-lv慢病毒载体的构建及病毒包装peg3启动子、fth1基因（委托汉恒生物有限公司合成）与载体p hblv-cmv-mcs-3flag-ef1-zsgreen-puro通过酶切、扩增、连接得到phblv-peg3-fth1-3flag-ef1-zsgreen-puro,测序鉴定构建成功后与质粒（p spax2、p md2g）同时感染293t细胞,收集病毒液离心得到病毒并标记为peg3-fth1-lv。同时构建cmv-fth1-lv作为阳性对照,并将未感染病毒的mscs细胞作为阴性对照。
2、慢病毒感染mscs并诱导瘤变待mscs细胞融合度达30%-40%,分别添加含peg3-fth1-lv、c mv-fth1-lv病毒培养基,感染48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,嘌呤霉素筛选构建稳定表达株mscs-peg3-fth1、mscs-cm v-fth1。将mscs、mscs-peg3-fth1、mscs-cmv-fth1分别与大鼠胶质瘤细胞c6间接共培养2周诱导其瘤变为tmscs、tmscs-peg3-fth1、tmscs-cmv-fth1。
3、诱导前后细胞的鉴定观察共培养前后细胞形态,细胞流式检测共培养前后细胞表面抗体cd29、cd34、cd45、cd90表达情况,结晶紫染色检测诱导前后细胞迁移能力,cck-8检测诱导前后细胞增殖速度,裸鼠皮下成瘤实验验证细胞瘤变。
4、诱导前后细胞fth1表达及聚铁western blots检测诱导前后细胞fth1表达,诱导前后细胞分别经fac培养基作用72h后,3.0t mri观察细胞t2wi信号,普鲁士蓝染色、细胞透射电镜观察细胞诱导前后fth1基因表达所引起的聚铁效应。
5、诱导后细胞移植物聚铁效应检测选取4-6w、20g左右健康雄性裸鼠,将诱导后细胞种植于裸鼠颈背部皮下,每天500mmol/l fac溶液喂养,于细胞种植后第1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d行3.0t mr观察移植物t2wi信号;细胞移植后形成的移植物取出后行普鲁士蓝染色及透射电镜观察肿块内铁颗粒情况,行苏木素-尹红染色观察其病理结构。