黄qu霉毒素 m1 是牛奶中主要的一种黄qu霉毒素。欧盟委员会 (ec) 规定欧洲婴儿配 方奶中该物质的大浓度为 0.025 µg/kg。在美国，食品和* (fda) 规定 牛奶中黄qu霉毒素的干预浓度为 0.5 µg/kg。本应用简报介绍了采用 agilent bond elut 增强型脂质去除产品 emr-lipid 通过 lc/ms/ms 对婴儿配方奶中的黄qu霉毒素 m1、g2、 g1、b2 和 b1 进行测定。本研究首先采用 quechers 萃取，然后采用 emr-lipid 分散 式固相萃取 (dspe) 进行净化。该方法可使所有浓度的所有黄qu霉毒素实现出色的回收 率 (88%-113%) 与精密度 (rsd = 1.3%-13.6%)。由于充分的基质去除，其定量限 (loq) 要远远低于美国和欧洲的法规限值。这一简单而稳定的方法仅需极少设备和专业技术， 因此可在食品实验室中实现轻松应用
真菌毒素是真菌的次生代谢产物，是食品和饲料供应中常 见的污染物之一。粮食及农业组织 (fao) 估计世界上有多 达 25% 的农产品受到了真菌毒素的污染。这种污染会造成灾难 性的经济损失，对粮食产业而言更是如此 [1]。黄qu霉毒素（表 1） 是由多种真菌（特别是黄qu霉和寄生曲霉）产生的一类真菌毒 素 [2]。黄qu霉毒素 m1 是牛奶中常见的真菌毒素，奶牛食用 了受黄qu霉毒素 b1 污染的饲料并对其进行代谢后即可产生黄qu霉毒素 m1 [3]。美国食品和* (fda) 以及欧盟委 员会 (ec) 均已对多种食品中的黄qu霉毒素限值进行了规定 [4,5]。 表 2 总结了美国和欧洲的 fda 和 ec 黄qu霉毒素限值。
黄qu霉毒素的法规限值极低，在婴儿食用的乳制品基质和配方奶 中更是如此。为去除基质干扰以增强低浓度下的分析物信号，样 品前处理*。通常使用免疫亲和柱分析多种包括黄qu霉毒 素在内的真菌毒素 [6-9]。但这类色谱柱价格昂贵，并需要采用 对食品实验室来说并不方便的*的多种工作流程。快速、简便、 经济、、耐用和安全的 quechers 方法针对样品采用简单的 三步流程（萃取、净化和分析）。因此，该方法在谷物和乳制品 中包括黄qu霉毒素在内的多种不同分析物和基质的前处理方面极 具前景 [3,10,11]。但通过 c18 或 psa 进行的 quechers 净化 在分析肉类和牛奶等含有大量脂质的样品时有一定限制。这种限 制来自于与目标分析物的非选择性相互作用以及几乎无法去除的 主要脂类物质。所有残留的脂质均会聚集于分析流路中，从而导 致维护次数增加、色谱图异常，并大大降低数据准确度和精密度。
agilent bond elut 增强型脂质去除产品 emr-lipid 是一种新型 吸附剂，该产品结合了*的体积排阻和疏水相互作用，可选择 性去除样品中的主要脂类，且不会保留不需要的其他分析物。这 种吸附剂可用于通过 quechers 进行的 dspe 净化以及蛋白质 沉淀工作流程，有助于实现简单的净化 [12,13]。本研究对 婴儿配方奶中的五种黄qu霉毒素进行了分析。婴儿配方奶富含脂 质且有明确的黄qu霉毒素法规限值，因此选择它作为基质。在 quechers 萃取后进行 emr-lipid dspe 净化，并使用无水 mgso4 进行增强的样品（净化）后处理（步骤），可获得出色的 基质去除效果。本应用简报证实了 emr-lipid 在三种不同浓度的 黄qu霉毒素分析中的有效性。
实验部分 试剂与化学品 所有试剂均为 hplc 级或更高等级。乙腈 (acn) 和甲醇购自 honeywell (muskegon, mi, usa)。水的净化处理由 emd millipore milli-q integral 系统 (darmstadt, germany) 完成。试剂级甲酸 （fa，部件号 g2453-85060）来自安捷伦科技公司。欧洲标准 物质 erm-bd283（含低浓度黄qu霉毒素 m1 的全脂奶粉）购自 lgc standards (teddington, middlesex, uk)。黄qu霉毒素 m1 （10 µg/ml，溶于乙腈）、黄qu霉毒素混合物（b1、g1、b2、 g2：均为 20 µg/ml，溶于乙腈）以及甲酸铵购自 sigma-aldrich 公司 (st. louis, mo, usa)。根据生厂商的建议，黄qu霉毒素标 准储备溶液分别在 2-8 °c (m1) 以及 -20 °c（b1、b2、g1、g2 混合物）下储存。液态即食婴儿配方奶购自当地杂货店。
设备 所用的仪器与材料： • eppendorf 移液器和连续分液器 • 涡旋仪和多管涡旋仪 (vwr, radnor, pa, usa) • geno/grinder (spex, metuchen, nj, usa) • centra cl3r 离心机 (thermo iec, ma, usa) • turbovap lv (biotage, charlotte, nc, usa) • eppendorf 微量离心机 (brinkmann instruments, westbury, ny, usa) • agilent bond elut 早期 quechers 方法（无缓冲盐）萃取试 剂盒（10 g 样品），配有陶瓷均质子（部件号 5982-5550ch） • agilent bond elut emr-lipid dspe 增强型脂质去除净化管 （部件号 5982-1010） • agilent bond elut emr-lipid polish mgso4 反萃管（部件号 5982-0102）
仪器 采用 agilent 1290 infinity lc 进行分析，其中包括： • agilent 1290 infinity 二元泵 (g4220a) • 配备 agilent 1290 fc/als 温控装置 (g1330b) 的 agilent 1290 infinity 高性能自动进样器 (g4226a) • agilent 1290 infinity 柱温箱 (g1316c) 该液相色谱系统联用配备安捷伦喷射流电喷雾离子化技术的 agilent 6460a 三重四极杆 lc/ms/ms 液质联用系统。采用 agilent masshunter 工作站软件进行所有的数据采集和分析。
样品前处理 取液态婴儿配方奶 (10 ml) 加入 50 ml 离心管中，并添加适量 标准品作为质量控制 (qc) 样品。加入两粒陶瓷均质子及 10 ml 乙腈，然后将样品涡旋混合 2 分钟。在样品中加入早期（非缓冲 盐，10 g 样品）quechers 萃取盐包。在机械振荡器中将样品混合 2 分钟，然后在 5000 rpm 下离心 5 分钟。在 emr-lipid dspe 增强型脂质去除净化管中加入 5 ml 水，然后加入 5 ml 样品粗 提物。立即对样品进行涡旋混合，然后用多管涡旋仪继续涡旋混 合 60 秒。将样品在 5000 rpm 下离心 5 分钟，然后将其倒入另一 个空的 15 ml 离心管中。将 polish 除脂萃取盐包中的无水硫酸 镁 (mgso4) 加入萃取液中。立即将样品涡旋混合 60 秒以分散其 中的盐，然后以 5000 rpm 离心 3 分钟。将上清液移至含有 1.5 g mgso4（来自新的 polish 除脂萃取盐包）的 15 ml 离心管中。立 即对样品进行涡旋混合，然后再次涡旋混合 60 秒。以 5000 rpm 离心 3 分钟后，将终样品 (1 ml) 转移至一个 16 × 100 mm 的 玻璃试管中，并在 50 °c 下用氮气吹干。吹干前需要向空白基质 中加入校准标样。用 100 µl 含有 0.1% 甲酸/乙腈 (80/20) 的水 对样品进行复溶，并涡旋混合至少 2 分钟。然后对样品进行超声 处理与离心（如需要）。将终样品转移至带内衬管的样品瓶中 进行 lc/ms/ms 分析。图 1 展示了整个样品前处理过程。
校准标样和质量控制 将储备液用乙腈稀释制得黄qu霉毒素工作溶液，浓度分别为 2 µg/ml（黄qu霉毒素 m1）和 10 µg/ml（黄qu霉毒素 g2、g1、 b2 和 b1）。为满足不同的法规限值要求，黄qu霉毒素 m1 的浓 度比其他黄qu霉毒素的浓度低 5 倍。通过对工作溶液进行适当稀 释而制得 100x 终浓度的校准品和 qc 标准品。表 4 列出了婴 儿配方奶中校准品和 qc 样品的终浓度。将工作溶液、所有校 准品及所有 qc 标准品均置于棕色瓶于 2-8 °c 下储存。在萃取前， 向基质空白婴儿配方奶中加入 100 µl 的相应 qc 标准品。而对 于基质匹配校准标样，在吹干前向 990 µl 的基质空白乙腈萃取液 中加入 10 µl 适当校准标样。
结果与讨论 方法优化 emr-lipid 可用于蛋白质沉淀和 quechers 工作流程中。初步 测试表明，蛋白质沉淀和 quechers 流程均适用于液态婴儿配方 奶中的黄qu霉毒素分析。而由于传统蛋白质沉淀过程中的稀释因 子较大，故在本应用中选择 quechers 方法。在进行了预实验后， 对本应用选择了早期 quechers 萃取盐，但 aoac 与 en 萃取 盐均适用。根据信噪比 (s/n) 标准得知，为达到黄qu霉毒素 m1 的预期定量 限 (loq)，需要对样品采用浓缩步骤。分别对 5x、10x 和 20x 浓 度进行评估后发现，在给定的仪器设置下，10x 浓度可满足 loq 和方法的需求。图 2 展示了在经过 quechers 萃取、emr-lipid 净化以及采用 mgso4 的增强的样品（净化）后处理（步骤），婴 儿配方奶中黄qu霉毒素的 lc/ms/ms dmrm 色谱图。