实验步骤先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物不能在模板的非目的位点引发dna 聚合反应(即错配) ，再次引物与引物之间避免形成稳定的聚体或发夹结构。引物设计应注意如下要点：1．引物的长度般为15-30 bp，常用的是18-27 bp。2．引物序列在模板内应当没有相似性较，尤其是3’端相似性较的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如ggg 或ccc，也会使错误引发机率增加。3．引物3’端的末位碱基对taq 酶的dna 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为a 的错配效率明显于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基a。4．引物序列的gc 含量般为40-60%，过或过低都不利于引发反应。上下游引物的gc含量不能相差太大。5．引物的另个重要参数是熔解温度（tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链dna分子时的温度。合理的退火温度从55℃到70℃。为获得结果，两个引物应具有近似的tm值。6．引物聚体或发夹结构也可能导致pcr 反应失败。应该尽量避免。
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