尽管嵌合抗原受体（car-t）细胞改变了治疗b细胞恶性肿瘤的前景，但由于大多数肿瘤靶抗原是与正常细胞共享，导致了car-t对实体瘤治疗的毒副作用，所以在一定程度上阻碍了其在实体瘤治疗中的发展。因此，很多研究人员试图应用布尔逻辑门控（boolean logic gate, 就是and,or,not）方法对car-t细胞进行预防毒性。
t细胞有两种car，针对两种肿瘤特异性抗原（taa），两种car带有不同的传导信号激发因子。只有两种car同时结合两种taa，才能共激发对肿瘤杀伤效应的信号转导称为and；一旦结合一种正常细胞表达的抗原就不激发称为not；结合一种taa就激发称为or。
最近的一篇来自于斯坦福大学的nature文章中[2]，作者使用zap-70（一种细胞内近端t细胞信号分子）取代传统的cd3ζ 结构域分子，可以激活t细胞并在体内根除肿瘤，同时可以绕过上游信号传导。zap-70的主要作用是磷酸化lat和slp-76，于是将lat和slp-76设计成基于and的逻辑门控细胞内网络（link car）。但是从这篇文章来看，这种and设计并不是一帆风顺的。
这篇文章评估car-t细胞杀伤作用的主要方法用到了大家耳熟能详的incucyte® 实时活细胞分析系统，incucyte® 也成为这篇nature的核心技术。
在设计and逻辑门的car时，一个关键问题是如何避免出现自发二聚体，降低肿瘤杀伤的特异性作用。
首先，是对不同跨膜域的选择，考虑到如果用同样的跨膜结构域可能会产生二聚体，所以应尽量使用不同的跨膜结构域。基于此，作者首先研究了aa，bb，ab，ba四种跨膜域组合（a为cd28tm，b为cd8tm）。
图3：incucyte® 实验显示,只有cd19-28tm-lat+her2-8tm-slp-76（ab组合）显示出了一定的and作用，但是仍然杀伤了cd19单阳。
为了进一步降低同源二聚或者异源二聚的可能性，突变了cd28tm上的一个半胱氨酸位点（2ca），但是仍然无法提高特异性。
lat和slp-76不会结合，为什么还是不行呢？作者进一步研究了这个信号通路发现，下游的一个适配分子 gads，可能会同时和两个car结合，所以依然会形成二聚体。所以将两个car上的gads结合位点的敲除后，特异性就提高了，真正获得了and效果！
当然作者也尝试了其他抗原组合，比如cd19和ror1，这种link car依然有效！
当然这种and效果方法不只一个，比如synnotch，但是相对于synnotch，这篇文章的link显示出更佳的特异性。
这种car可以扩大car-t细胞靶向的分子范围，并将使car-t能够用于实体瘤和自身免疫等疾病和纤维化。此外，这项工作表明，细胞的内部信号机制可以重新利用为表面受体，其可能为细胞工程开辟新的途径。
为什么越来越多的高分文章都使用了incucyte® ？
-参考文献-
[1] engineering car-t cells for next-generation cancer therapy.cancer cell,2020
[2] co-opting signalling molecules enables logic-gated control of car tcells.nature,2023