单细胞分离是研究中困难的步骤之一，目前的分离策略主要分为三类：手动分离、荧光激活的细胞分选和微流体技术。
在进行单细胞转录分析之前，我们需要确定自己拿到了正确的细胞。如果你想要的细胞已经处于悬浮状态（比如循环肿瘤细胞），而且含量相对比较丰富，那么流式细胞分析将是你的理想选择。如果样本是实体组织，我们可以用酶分解掉胶原和其他细胞外蛋白。不过酶学消化对细胞影响较大，甚至可能改变基因转录情况。
把组织细胞制成悬液之后，我们就可以通过特异性的荧光标签分离出自己想要的细胞，进一步拿到单细胞是比较棘手的一步，可能需要用到微流体设备。
单细胞分离法是一种从待分离的材料中直接分离单个细胞进行培养获得纯培养的方法。该法在显微镜下操作，对于体积较大的微生物，可以用毛细管提取微生物个体；对较小的细胞或孢子，可以用*、钩、环等挑取以获得单细胞；也可将适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含有一个细胞的液滴培养。
对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下进行。目前，市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或*、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。
在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行细胞分离，例如，将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液滴进行培养以获得纯培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。