使用 rnastorm™ 试剂盒获得的 rna 中是否存在任何污染的基因组 dna？基因组 dna 的污染是一个大问题，因为它会干扰下游应用。 rnastorm™ 试剂盒包括优化的 dnase 消化步骤，可去除污染的基因组 dna，而不显着影响 rna 产量。虽然此步骤是可选的，但强烈建议这样做。
我期望从 ffpe 样品中获得多少 rna？影响获得的rna总量的最大变量是样品本身的质量（即组织的类型和数量，以及样品分离和保存的注意事项）。使用 rnastorm™ 试剂盒，并假设至少合理的样品质量，可以获得大于 1 µg 的量。
使用rnastorm™试剂盒获得的rna可以用于rna-seq吗？是的。只要 rna 的质量足够高，就可以获得高质量的文库。对于 illumina 测序，建议 dv200 至少为 30%，并且应使用提供至少 1 µg rna 的样品。
组织应该如何准备？使用切片机从 ffpe 样品中获取 5-10 µm 的切片。如果可以可靠地切割，可以使用小于 5 µm 的切片。不建议使用厚度超过 10 µm 的切片，因为它们可能无法全消化。此外，每次提取应使用不超过 5 个切片（每个 10 µm）。使用过多的组织会导致消化不全并降低产量。
我可以使用非石蜡包埋的组织吗？是的，可以使用未包埋在石蜡中的组织。在这种情况下，我们建议机械研磨相当于推荐切片数量的组织。
我可以使用 ffpe 芯吗？是的，可以使用 ffpe 芯材。由于核心不使用切片机进行处理，因此样品消化往往更加困难，如果观察到消化不全，建议使用机械均质化（例如使用钢珠）。
您推荐哪种脱蜡方法？rnastorm™ 试剂盒包含推荐的脱蜡试剂。与其他常见方法（例如二甲苯）不同，脱蜡试剂高效、无毒，并且不需要使用通风柜。在我们的测试中，所包含的试剂在去除石蜡和纯化高质量核酸方面至少与二甲苯一样有效。
定量从 ffpe 样品中获得的 rna 的最佳方法是什么？与从新鲜样品中获得的 rna 相比，准确定量 ffpe 衍生的 rna 更具挑战性。仅仅知道存在的 rna 的绝对量是不够的，还要知道 rna 是否会在下游应用中发挥作用，这取决于以下因素：
片段大小分布：如果 5 µg 样品（通过 qubit 测量）包含 < 200 nt 的片段，则它对于 rna-seq 可能毫无用处。
化学修饰：对于从福尔马林固定的样品中获得的rna，各种化学加合物和交联，包括碱基修饰、碱基-碱基交联和碱基-蛋白质交联，可以使核酸分子无法被酶接触，从而在下游应用中失活。
污染：纯化过程中使用的细胞碎片、蛋白质、盐和洗涤剂可能会导致下游检测产生偏差。例如，nanodrop 等基于 uv/vis 的方法特别容易受到 200-280 nm 范围内吸收的污染物的影响。
基于荧光的方法（例如 qubit）容易出现重大错误。当使用低浓度的 dna 或 rna 时，基于染料的检测可能不是线性的。还必须注意 rna 样品中基因组 dna 的污染，因为用于荧光定量的染料并不全针对 ffpe 衍生的 dna 或 rna。
定量 pcr 是定量严重受损和修饰核酸的方法。
是否应该使用 rin 编号来确定 ffpe 衍生 rna 的质量？尽管 rin 数可以提供有关样品碎片程度的一般信息，但它不够灵敏或可预测，不足以成为下游性能的有用指标，尤其是对于 rna-seq。通常，ffpe 衍生 rna 的 rin 编号在 2 到 3 之间。其中一些样本对 rna-seq 有用，而另一些则不会——但是，rin 不会告诉您。
使用 illumina 测序的 rna-seq性能预测指标稍好一些的是 dv200，它代表长度超过 200 个核苷酸的 rna 片段的百分比。 dv200 也是基于生物分析仪数据计算的，但与所有基于生物分析仪的方法具有相同的缺点，特别是高变异性。
从 ffpe 样品中提取 rna 时我需要了解什么？避免基于有机溶剂 (trizol) 的方法
避免刺激性离液盐（即胍盐）
避免使用影响 uv 和/或 qubit 下游定量的清洁剂（例如 triton x-100）
请勿依赖 rin 来定量 ffpe 衍生样品的完整性。看看为什么。请改用 dv200。
使用去除福尔马林化学修饰的试剂盒或方法。请勿将温度升至 80°c 或以上。即使在此温度下停留很短的时间也会显着降低完整性。
请警惕 qubit 和 nanodrop 浓度，因为可能会受到有机分子或 dna 污染。
使用 qpcr 定量 rna，并始终仔细观察熔解曲线以确定是否发生非特异性扩增。