酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记spa等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中*常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称hrp)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
酶制剂及其底物：
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：
(1)来源方便，易于纯化；
(2)比活性高，性质稳定；
(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(hrp)和硷性磷酸酶(ap)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌mei和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, hrp)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以*常用。hrp广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。hrp由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为ph3～9,酶催化的最适ph因供氢体不同而稍有差异，但多在ph5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。hrp的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以od403nm ／od275nm的比值rz(德文reinheit zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶rz值应在3.0左右(最高可达3.4)。rz值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，rz值仍可不变。
hrp的催化反应需要底物过氧化氢(h2o2)和供氢体(dh2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(d)。酶促反应的过程如下:
　hrp
dh2＋h2o2────→d＋2h2o
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如dab(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5as(5-氨基水杨酸)早期曾用于elisa，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。ot(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：opd(邻苯二胺)和tmb(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称abts[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，abts与tmb皆是值得被优选的供氢体。
由于hrp的底物h2o2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的h2o2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明h２o２已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物颜色。