中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
sn/t 2318-2009
动物源食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜残留量的检测高效液相色谱-质谱/质谱法
determination of diclazuril，toltrazuril，toltrazuril sulfoxide
and toltrazuril sulfone residues in foodstuffs of animal origin-
hplc-ms/ms method
1范围
本标准规定了动物源食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜残留量的高效液相色谱质谱/质谱检测方法。
本标准适用于鸡肉、鸡肝、鸡肾、猪肉、猪肝、猪肾、兔肉、兔肝、兔肾和鸡蛋中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
试样中的地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜残留用乙酸乙酯提取，通过凝胶渗透色谱(gpc)净化后，用高效液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)测定，内标法定量。
4试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为色谱纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
4.1乙腈。
4.2乙酸。
4.3环己烷。
4.4乙酸乙酯。
4.5甲醇。
4.6无水硫酸钠：分析纯，经650℃灼烧4h.置于干燥器内备用。
4.7乙酸乙酯-环己烷(50+50)：相同体积的乙酸乙酯与环己烷互溶。
4.8甲醇-水(80+20)：80体积的甲醇和20体积的水互溶。
4.9标准品：地克珠利(cas号：101831-37-2)、妥曲珠利(cas号：69004-03-1)、妥曲珠利亚砜(cas号：69004-15-5)、妥曲珠利砜(cas号：69004-04-2)和氘代妥曲珠利，纯度均大于等于98.0%。
4.10地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜标准储备液：分别称取每种标准品各10 mg(准确至0.1 mg)，用甲醇溶解，并分别定容到50 ml棕色容量瓶中，混匀，该溶液的浓度为200μg/ml，可在-18℃以下避光保存12个月。
4.11地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜混合标准中间液：分别取标准储备液(4.10)各0.5ml~10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成混合标准中间液，浓度为10μg/ml，可在-18℃以下避光保存6个月。
4.12地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜标准工作液：根据需要，吸取一定量的混合标准中间液(4.11)，用甲醇稀释至所需浓度，现用现配。
4.13内标标准储备溶液：称取氘代妥曲珠利标准品10 mg(准确至0.1 mg)，用甲醇溶解，并分别定容到50ml棕色容量瓶中，混匀，该溶液的浓度为200μg/ml，可在-18℃以下避光保存12个月。
4.14内标标准工作液：量取标准储备液(4.13)0.5ml~10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成内标工作液，浓度为10μg/ml，可在-18℃以下避光保存6个月。
4.15 0.45μm有机滤膜。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源( esi)。
5.2凝胶渗透色谱仪：配有紫外检测器(固定波长：254 nm)。
5.3涡旋振荡器。
5.4旋转蒸发器。
5.5均质器。
5.6离心机，最大转速大于等于3 000 r/ min。
6试样制备与保存
6.1动物肌肉、肝脏和肾脏样品
从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约0.5 kg，用组织捣碎机充分捣碎均匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记，于-18℃以下冷冻避光保存。
6.2禽蛋样品
从所取全部样品中取出约0.5kg，去壳，匀浆，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记，于-18℃以下冷冻避光保存。
7测定步骤
7.1提取
肌肉样品、禽蛋样品称取5g(精确至0.01g)，肾脏、肝脏样品称取2.5g(精确至0.01 g)于50 ml离心管中，加入50μl内标工作液(4.14)，涡旋混合30s后，加入25ml乙酸乙酯和5g无水硫酸钠，以10 000 r/min均质提取1 min，3 000r/min转速离心10min。然后禽蛋样品准确分取10 ml提取液，肌肉、肾脏、肝脏样品分取5 ml提取液于15 ml的玻璃管中，45℃下氮气吹干。用乙酸乙酯-环己烷(4.7)溶解残渣并定容至10ml，待gpc净化。
7.2净化
7.2.1凝胶渗透色谱条件
a)净化柱：22g s-x3 bio beads填料，200 mm×20 mm(内径)，或相当者；
b)流动相：乙酸乙酯环己烷(50+50，体积比)，流速：5.0 ml/min；
c)进样量：5 ml；
d)净化程序：弃去7.5 ml以前的洗脱液，收集7.5 min~12.5 min的洗脱液。
7.2.2净化过程
按上述的条件进行gpc净化。净化后将收集的洗脱液蒸干，用1 ml甲醇水(4.8)溶解残渣，涡漩振荡，过0.45μm滤膜，供hplc-ms/ms分析。
7.3高效液相色谱-串联质谱测定
7.3.1液相色谱条件
a)色谱柱：c18，150 mm×2.1 mm(内径)，5μm，或相当者；
b)流动相：0.1%乙酸水溶液-乙腈(45+55，体积比)；
c)流速：200μl/ min；
d)色谱柱温度：30℃；
e)进样量：10μl。
7.3.2质谱条件
a)离子化模式：电喷雾负离子扫描模式(esi-)；
b)质谱扫描方式：多反应监测(mrm)；
c)其他参考质谱条件参见附录a。
7.3.3测定
7.3.3.1定量测定
根据样液中被测物的含量情况，选定响应值相近的混合标准工作液。标准工作溶液和样液中分析物的响应值均应在仪器的检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参差进样测定。在上述仪器条件下，各分析物的参考保留时间为：妥曲珠利亚砜4.73 min、妥曲珠利砜7.81 min、地克珠利11.02 min、氘代妥曲珠利13.53 min、妥曲珠利13.61 min；标准品色谱图参见附录b。
7.3.3.2定性测定
地克珠利和妥曲珠利亚砜有两组离子对，能够定性分析。在相同实验条件下，在扣除背景后的样品质量色谱图中，所选择的离子对均出现。经对比所选离子对的丰度比与标准品离子对的丰度比，其值在允差范围内(允差范围值参见表1)，则可判断样品中存在对应的被测物。
7.4空白实验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
8结果计算和表述
试样中的残留含量，按式(1)计算：
式中：
x——试样中待测组分残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；
cs——标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
a——样品中被测组分峰面积；
as——混合标准工作溶液中被测组分的峰面积；
ci——样液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
csi——标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升( ng/ml)；
asi——标准工作溶液中内标物的峰面积；
ai——样液中内标物的峰面积；
v——样液最终定容体积，单位为毫升(ml)；
m——样品的重量，单位为克(g)。
9测定低限、回收率
9.1测定低限
本方法的测定低限：肾脏、肝脏为20μg/kg；肌肉为10μg/kg；禽蛋为1μg/kg。
9.2回收率
地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜、妥曲珠利砜在不同基质，三个不同添加水平的回收率范围参见附录c。