荧光定量pcr实验检测
实验原理
实时荧光定量pcr （quantitative real-time pcr）是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（pcr）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析的方法。real-timepcr是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时检测。由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
二、实验操作步骤：
1. 细胞培养及细胞传代
倒置显微镜观察细胞，评估细胞汇合的程度以及确认无细菌和真菌污染；移去培养皿（瓶）中的培养液；加入相当于培养液体积一半的pbs清洗单层细胞，一般三次即可；按1ml/25cm2表面积的量加入0.25%*消化单层细胞。摇晃培养皿（瓶）使其*覆盖细胞单层，倒出多余的*；将培养瓶放回培养箱，放置2-10 min；用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养皿（瓶）的一侧来释放残留的贴壁细胞；用少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以灭活*，取出100-200μl用于计数；将所需数量的细胞移至一个新标记好的温育过培养液的培养皿（瓶）中；选择适当培养条件培养细胞系；按照细胞系的生长特性重复该步骤，直到胞状态良好、无污染，可以铺板使用，其余选择冻存。2.活细胞计数
取一瓶传代的细胞，待长成单层以后使用；细胞悬液的制备方法：用0.25%的*消化、pbs洗涤后，加入培养液吹打制成待测细胞悬液。盖好盖玻片，取一套血球计数槽，制备计数用的细胞悬液：用吸管吸适量细胞悬液到离心管中，加入等体积台盼蓝染液，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可不使用台盼蓝染色。将细胞悬液滴入计数板，注意盖玻片下不要有气泡，也不要悬液流入旁边槽中。统计四个大格的细胞数，将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的大格（每格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。计算原细胞悬液的细胞数。按照下面公式计算细胞密度：6）（细胞悬液的细胞数）/ml = (四个大格子细胞数/4）×2×104
3.细胞处理
4.rna提取
1）细胞中加入1ml trizol，将细胞裂解吸到一个1.5ml的ep管中；
2）加入200ul氯1仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5分钟；
3）12000rpm，4℃15min 4℃；
4）转上层水相（约400ul）于新1.5ml ep管中，加入400ul异丙醇，混匀，室温静置10min；；
5）12000rpm 10min 4℃；
6）弃上清，沉淀用预冷的70%无水乙醇洗3次，空气干燥5-10分钟，溶于20uldepc水中；
7）分光光度计测定rna浓度。
5.rna cdna第.一链合成
将逆转所需要的物品准备好，rna浓度计算好，tube准备并标记上；在冰浴的nuclease-free pcr管中加入试剂轻轻混匀，42度孵育15分钟。85度加热5秒失活transscript rt/ri和gdna remover。将上述溶液-20°c保存。6.荧光定量pcr检测
将cdna样品稀释10倍作为模板上机检测。配制反应混合液pcr循环条件仪器的操作完成上述步骤后，把加好样品的96孔板放在abi stepone plus型荧光定量pcr仪中进行反应。