规格：100管/48样
亚硝酸还原酶（nitrite reductase，nir ）试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
硝酸还原酶（nir）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为no或nh3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。
测定原理
亚硝酸还原酶可将no2-还原为no，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的no2-减少，即 540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。
需自备的仪器和用品
天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、水浴锅、低温离心机。
试剂的组成和配制
试剂一：液体 112ml×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 1.5ml×1 支，4℃保存。
试剂三：液体 1ml×1 支，4℃保存。
试剂四：粉剂×1 支，4℃避光保存。临用前加0.6ml蒸馏水充分溶解。
试剂五：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加3.2ml蒸馏水充分溶解。
显色剂 a：液体 2 ml×1 瓶，4℃避光保存。
显色剂 b：液体 2ml×1 瓶，4℃避光保存。
临用前，根据用量将显色剂a和显色剂b按1:1的比例混合。
酶液提取
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2．细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1ml试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。
测定操作表
空白管
对照管
测定管
试剂一（μl）
140
120
110
试剂二（μl）
12
12
12
试剂三（μl）
10
10
试剂四（μl）
6
6
6
试剂五（μl）
32
32
32
样品（μl）
30
30
混匀后，37℃反应 1h
显色剂（μl）
40
40
40
充分混匀，25℃静置显色10min，用蒸馏水调零，于微量石英比色皿/96孔板中测定540nm各管吸光值，分别记为a空白管、a对照管、a测定管。
注意：空白管只需测定一次。
计算公式
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.0136x-0.005，r2=0.9981
1．按照蛋白含量计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原1μmol no2ˉ的量为一个酶活力单位。
nir（μmol/h/mg prot）=[a空白管-(a测定管-a对照管)+0.005]÷0.0136×v反总÷（v样×cpr）÷t=490.2×（a 空白管-a 测定管+a 对照管+0.005）÷cpr
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每小时还原1μmol no2ˉ的量为一个酶活力单位。
nir（μmol/h/g）=[a 空白管-(a 测定管-a 对照管)+0.005]÷0.0136×v 反总÷（w×v 样÷v 样总）÷t= 490.2×（a 空白管-a 测定管+a 对照管+0.005）÷w
3. 按照细胞数量计算
酶活单位定义：每104个细胞每小时还原1μmol no2ˉ的量为一个酶活力单位。
nir（μmol/h/104cell）=[a 空白管-(a 测定管-a 对照管)+0.005]÷0.0136×v 反总÷（细胞数量×v样÷v 样总）÷t=490.2×（a 空白管-a 测定管+a 对照管+0.005）÷ 细胞数量
v 反总：反应体系总体积，0.2ml；v 样：体系中加入样本体积，0.03ml；v 样总：加入提取液体积，1ml；t：反应时间，1h； cpr：样本蛋白含量；w：样本质量，g
b. 使用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y =0.0068x-0.005，r2=0.9981
1．按照蛋白含量计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原1μmol no2ˉ的量为一个酶活力单位。
nir（μmol/h/mg prot）= [a 空白管-(a 测定管-a 对照管)+0.005]÷0.0068×v 反总÷（v 样×cpr）÷t= 980.4×（a 空白管-a 测定管+a 对照管+0.005）÷cpr
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每小时还原1μmol no2ˉ的量为一个酶活力单位。
nir（μmol/h/g）= [a 空白管-(a 测定管-a 对照管)+0.005]÷0.0068×v 反总÷（w×v 样÷v 样总）÷t= 980.4×（a 空白管-a 测定管+a 对照管+0.005）÷w
3. 按照细胞数量计算
酶活单位定义：每104个细胞每小时还原1μmol no2ˉ的量为一个酶活力单位。
nir（μmol/h/104cell）= [a空白管-(a测定管-a对照管)+0.005]÷0.0068×v 反总÷（细胞数量×v样÷v样总）÷t= 980.4×（a空白管-a测定管+a 对照管+0.005）÷ 细胞数量
v 反总：反应体系总体积，0.2ml；v 样：体系中加入样本体积，0.03ml；v 样总：加入提
取液体积，1ml；t：反应时间，1h； cpr：样本蛋白含量；w：样本质量，g
注意事项
配制好的试剂三、试剂四3天内使用完。
关键词：分光光度计 酶标仪 水浴锅 离心机