1.什么是dna甲基化？dna甲基化是在dna甲基化转移酶(dnmt)的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶（5-mc）的过程。
2.dna甲基化与基因表达调控dna复制后胞嘧啶的甲基化会改变dna的构象，使dna的大沟无法与dna结合蛋白正常结合，从而使这些非编码区长期保持无表达活性的状态。而有转录活性的基因可利用非甲基化的启动子来进行转录表达。
3.dna甲基化主要发生在cpg位点cpg位点（cpg sites）是指dna的某个区域，其上的碱基序列以胞嘧啶接着鸟嘌呤出现。“cpg”是“c—磷酸—g”的缩写。 cpg位点在人类基因组上并非随机分布，在人类基因组上的频率为1%。
•dna甲基化主要发生在cpg位点。在哺乳动物中，70%到80%的cpg位点的胞嘧啶是甲基化的。
•cpg岛是一个富含cpg位点的区域，通常定义为：一个长度至少为200bp的片段
，其gc含量高于60%，主要位于基因的启动子区（70%的基因）。
二、全基因组甲基化研究策略
优点：通量高 ，全基因组范围；单碱基分辨率。
缺点：成本高，不适于大样本研究分析；不适于特异位点、基因或区段研究。
三、特异位点甲基化研究策略bisulfite sequencing pcr (bsp): 基因组dna经亚硫酸氢盐处理后，设计bsp引物扩增目的片段，最后对pcr产物进行克隆并选取8-10个转化子序列，即可确定所研究的cpg区域的甲基化频率。
methylation specific pcr (msp) ：首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组dna，然后针对甲基化和非甲基化引物进行pcr扩增，确定与引物互补的dna序列的甲基化状态。
缺点：通量太小、无法精确定量
翼和方法：
bisulfite amplicon sequencing (bsas)
优势：bsas 结合了亚硫酸盐转换、靶向扩增子高通量测序技术，可实现多区段、多位点的甲基化精确定量分析。
应用：1、 适用于感兴趣的目的片段的甲基化研究 ；
2、适用于在大样本中进一步确认全基因组甲基化研究挑选的阳性位点。
文献：1、 masser et al. epigenetics & chromatin 2013, 6:33
2、ashktorab et al. epigenetics 2014, 9(4): 503-512
3、beth et al. j child psychol psyc 2016,2(57):152-160
关键点-引物设计
尽量避免cpg位点，无法避免时，可设计兼并引物；
经亚硫酸盐处理后，两条dna链不再互补，一般需要设计链特异性引物用于pcr扩增；
如果只选一条链进行研究，一般选择正义链。
关键点-转换效率
亚硫酸盐处理是一化学过程，可造成dna的损伤，很难同时实现转换效率和保持dna的完整性，二者需要做出一定的平衡。
转换效率 = 未转换碱基读数/总碱基读数 【针对dna序列中的c位点】
如何评估转换效率？
 在植物中，叶绿体中不含甲基胞嘧啶 dna，因此，可用叶绿体dna序列信息作为内对照，评估转换效率。
 在动物中，可通过在试验中加入未发生甲基化的外源dna序列（通常为噬菌体dna）来评估转换效率；此外，还可利用cpg位点以外的c位点信息来评估。
关键点-目的片段富集
采用巢式pcr，确保目的片段有效富集
经亚硫酸盐处理后，dna序列复杂度严重降低。应严格控制建库pcr的循环数，降低非特异性扩增。
关键点-甲基化判断通过将参考序列中的c碱基全部替换为t碱基，然后将测序reads比对到转换后的参考序列上，针对每一个cpg位点，统计c和t碱基的读数（类似于snp calling），来判断该位点的甲基化。
甲基化率：对于每一个cpg位点，甲基化率 = c碱基读数/该位点测序覆盖度。
甲基化状态：利用内对照得出的转换效率作为期望概率，通过二项分布统计，得到p值，判断每个cpg位点是否发生甲基化，多位点分析时，通常需要对p值进行矫正（错误发生率，fdr）。